發(fā)布時(shí)間：2018-03-13 10:06

  本文選題：趨化因子　切入點(diǎn)：CXCL13　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖和轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生的根本,臨床上腫瘤常以全身性的破壞形式出現(xiàn),表現(xiàn)為一系列的癥狀。全球每年新發(fā)的癌癥病例有900萬(wàn)例之多,其中30%~50%的癌癥患者經(jīng)歷各種形式的疼痛,特別是晚期癌癥患者伴有疼痛比例可高達(dá)75%~90%。在腫瘤引起的各種形式的疼痛中,轉(zhuǎn)移性骨癌痛是最常見的類型之一,嚴(yán)重影響患者的生活,造成重大心理負(fù)擔(dān)。目前骨癌痛的發(fā)生機(jī)制我們理解的還不是太充分,骨癌痛治療方面也不盡如人意。世界衛(wèi)生組織指南指出骨癌痛的治療按階梯治療從非阿片類藥到強(qiáng)阿片類藥,同時(shí)給予輔助性的治療如雙磷酸鹽、局部放射治療等�；诖�,有必要對(duì)骨癌痛的機(jī)制做進(jìn)一步研究,目前大家公認(rèn)的與骨癌痛的發(fā)生機(jī)制包括:興奮性的突觸的產(chǎn)生、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活和促炎介質(zhì)的高表達(dá)。其中促炎介質(zhì)中的趨化因子在骨癌痛發(fā)展中的作用目前引起了極大的關(guān)注。作為細(xì)胞因子中的具有趨化作用的一類小分子,有50多個(gè)家庭成員,主要介導(dǎo)外周免疫系統(tǒng)細(xì)胞的遷徙。近來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)趨化因子不單單表達(dá)于外周神經(jīng)系統(tǒng),還表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng),參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理性和病理性的調(diào)節(jié)。根據(jù)趨化因子家族中四個(gè)保守半胱氨酸殘基的順序?qū)⑵浞譃?類。原則上,趨化因子和其同來(lái)源的受體相結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用,結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。目前為止,發(fā)現(xiàn)的和骨癌痛相關(guān)的趨化因子及其受體包括ccl2/ccr2、cx3cl1/cx3cr1、ccl5/ccr5、cxcl12/cxcr4、cxcl10/cxcr3和cxcl1/cxcr2。嗎啡是μ阿片受體激動(dòng)劑,通過(guò)阿片受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,是目前臨床常用的治療骨癌痛的藥物。前期基因芯片研究結(jié)果示骨癌痛大鼠中趨化因子cxcl13基因的高表達(dá)。近期在脊神經(jīng)結(jié)扎造成的神經(jīng)病理性痛模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)脊髓中趨化因子基因上調(diào),尤其是最初來(lái)源于b淋巴細(xì)胞淋巴結(jié)細(xì)胞基質(zhì)的cxcl13,其基因上調(diào)幅度最大。無(wú)論是在中樞還是在外周疼痛信號(hào)通路中,趨化因子和嗎啡在機(jī)體免疫、炎癥性成、神經(jīng)元的特定的反應(yīng)中都發(fā)揮了重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)的參與了嗎啡鎮(zhèn)痛的調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子包括cx3cl1、cxcl12、cxcl10、ccl2、ccl3和ccl5等。然而,在骨癌痛大鼠中,趨化因子cxcl13和嗎啡鎮(zhèn)痛之間的作用還沒(méi)有明確的研究。目的探究在正常大鼠和骨癌痛大鼠中趨化因子cxcl13對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響,從而為骨癌痛的治療提供新的依據(jù)。方法1.walker256乳腺癌細(xì)胞的制備購(gòu)自華中科技大學(xué)研究室的walker256乳腺癌細(xì)胞腹腔注射入重160~180g的清潔級(jí)sd雌性大鼠。注射后每天觀察種植癌細(xì)胞的大鼠腹部變化,待5~7天形成腹水后抽取。將抽取的腹水用d-hanks液漂洗離心至少3次,離心轉(zhuǎn)數(shù)600r/min,每次離心5min。所得癌細(xì)胞放于冰塊上備用。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)的sd雌性大鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,重約180~220g。喂養(yǎng)環(huán)境室溫在24±0.5°c,晝夜各12小時(shí),自由飲食。3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組骨癌痛模型建立:雌性清潔級(jí)sd大鼠24只,重約180~220g,隨機(jī)分為3組分別為正常組、假手術(shù)組、骨癌痛組。分別測(cè)定3組建模后0、1、3、5、7、10、14、21天大鼠的機(jī)械縮足閾值。cxcl13蛋白的表達(dá):雌性清潔級(jí)sd大鼠24只,重約180~220g,隨機(jī)分為2組分別為假手術(shù)組和骨癌痛組,用免疫印跡技術(shù)測(cè)定大鼠0、7、14、21天時(shí)大鼠cxcl13蛋白的表達(dá)水平。cxcl13對(duì)正常大鼠的作用:雌性清潔級(jí)sd大鼠24只,重約180~220g,隨機(jī)分為4組,分別為鹽水組、嗎啡組、cxcl13重組蛋白組、cxcl13重組蛋白+嗎啡組,鞘內(nèi)給藥后,分別測(cè)定給藥前、給藥后15min、30min、60min、90min和120min時(shí)大鼠機(jī)械縮足閾值的變化情況。cxcl13在骨癌痛大鼠中對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響:同正常大鼠。4.試驗(yàn)藥物及其給藥方式μ阿片藥物受體激動(dòng)劑,嗎啡購(gòu)自中國(guó)東北制藥集團(tuán)公司。大鼠cxcl13重組蛋白購(gòu)自美國(guó)的派普泰克公司。所有的藥物均是鞘內(nèi)給藥,將pe-10管置入脊髓蛛網(wǎng)膜下腰膨大部位,給藥體積為10ul。5.骨癌痛模型的制備根據(jù)既往骨癌痛模型的建立的報(bào)道,大鼠骨癌痛模型的建立采用購(gòu)自華中科技大學(xué)研究室的walker乳腺癌細(xì)胞(10ul4x106細(xì)胞/毫升)種植在大鼠近脛骨段的骨髓腔里。6.鞘內(nèi)置管與骨癌痛大鼠模型麻醉方式相同,按既往報(bào)道將pe-10導(dǎo)管置于大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔腰膨大的位置。7.行為學(xué)測(cè)試將大鼠放于帶有金屬絲網(wǎng)格的玻璃籠子里,測(cè)試前放置金屬絲網(wǎng)中30min。用vonfrey細(xì)絲測(cè)試所有大鼠的足趾的機(jī)械縮足閾值(mwt)。每次測(cè)試持續(xù)5s,每只大鼠重復(fù)測(cè)試5次,每次間隔10min。8.免疫印跡實(shí)驗(yàn)用蛋白免疫印跡的發(fā)法檢測(cè)骨癌痛大鼠和正常組大鼠在0、7、14、21天時(shí)cxcl13蛋白和其受體cxcr5的表達(dá)。結(jié)果1.與正常組和sham組相比,骨癌痛組在1、3、5、7、10、14、21天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常組和sham組相比,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的mwt值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。骨癌痛大鼠中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中與第0天相比第3、5、7、10、14、21時(shí)MWT值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),特別是14天時(shí),MWT的值最低,說(shuō)明骨癌痛模型建立成功。2.用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨癌痛組和假手術(shù)組中CXCL13蛋白和其受體CXCR5的表達(dá)水平。與sham組相比,骨癌痛大鼠在建模后7、14、21天中的CXCL13和CXCR5的表達(dá)量增加,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。建模后14天時(shí)CXCL13和CXCR5蛋白的表達(dá)量最多,與骨癌痛大鼠MWT值相一致,說(shuō)明骨癌痛大鼠中CXCL13的表達(dá)增加使大鼠的MWT值降低。3.正常大鼠中,與鹽水組相比,嗎啡組大鼠的MWT值明顯上升(P0.05),CXCL13重組蛋白組大鼠的MWT值明顯下降(P0.05)。與嗎啡組相比,CXCL13重組蛋白+嗎啡組的MWT值下降(P0.05)。說(shuō)明CXCL13對(duì)正常大鼠具有致痛作用并且減弱嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。4.骨癌痛大鼠中,與鹽水組相比,CXCL13重組蛋白組在60min時(shí)MWT值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),嗎啡組MWT值各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)且MWT值均升高。與單純嗎啡組相比,CXCL13重組蛋白+嗎啡混合物組的MWT值在30min、60min時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。進(jìn)一步說(shuō)明在骨癌痛大鼠中CXCL13對(duì)嗎啡的鎮(zhèn)痛具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。結(jié)論趨化因子CXCL13具有致痛作用,在骨癌痛大鼠中其表達(dá)的上調(diào)減弱嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.5

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本文編號(hào)：1605908