本文選題：趨化因子　切入點：CXCL13　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景腫瘤細胞的無限增殖和轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生的根本,臨床上腫瘤常以全身性的破壞形式出現(xiàn),表現(xiàn)為一系列的癥狀。全球每年新發(fā)的癌癥病例有900萬例之多,其中30%~50%的癌癥患者經(jīng)歷各種形式的疼痛,特別是晚期癌癥患者伴有疼痛比例可高達75%~90%。在腫瘤引起的各種形式的疼痛中,轉(zhuǎn)移性骨癌痛是最常見的類型之一,嚴重影響患者的生活,造成重大心理負擔。目前骨癌痛的發(fā)生機制我們理解的還不是太充分,骨癌痛治療方面也不盡如人意。世界衛(wèi)生組織指南指出骨癌痛的治療按階梯治療從非阿片類藥到強阿片類藥,同時給予輔助性的治療如雙磷酸鹽、局部放射治療等。基于此,有必要對骨癌痛的機制做進一步研究,目前大家公認的與骨癌痛的發(fā)生機制包括:興奮性的突觸的產(chǎn)生、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活和促炎介質(zhì)的高表達。其中促炎介質(zhì)中的趨化因子在骨癌痛發(fā)展中的作用目前引起了極大的關(guān)注。作為細胞因子中的具有趨化作用的一類小分子,有50多個家庭成員,主要介導(dǎo)外周免疫系統(tǒng)細胞的遷徙。近來越來越多的證據(jù)證實趨化因子不單單表達于外周神經(jīng)系統(tǒng),還表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng),參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理性和病理性的調(diào)節(jié)。根據(jù)趨化因子家族中四個保守半胱氨酸殘基的順序?qū)⑵浞譃?類。原則上,趨化因子和其同來源的受體相結(jié)合來發(fā)揮作用,結(jié)合后激活細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路。目前為止,發(fā)現(xiàn)的和骨癌痛相關(guān)的趨化因子及其受體包括ccl2/ccr2、cx3cl1/cx3cr1、ccl5/ccr5、cxcl12/cxcr4、cxcl10/cxcr3和cxcl1/cxcr2。嗎啡是μ阿片受體激動劑,通過阿片受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,是目前臨床常用的治療骨癌痛的藥物。前期基因芯片研究結(jié)果示骨癌痛大鼠中趨化因子cxcl13基因的高表達。近期在脊神經(jīng)結(jié)扎造成的神經(jīng)病理性痛模型實驗中發(fā)現(xiàn)脊髓中趨化因子基因上調(diào),尤其是最初來源于b淋巴細胞淋巴結(jié)細胞基質(zhì)的cxcl13,其基因上調(diào)幅度最大。無論是在中樞還是在外周疼痛信號通路中,趨化因子和嗎啡在機體免疫、炎癥性成、神經(jīng)元的特定的反應(yīng)中都發(fā)揮了重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)的參與了嗎啡鎮(zhèn)痛的調(diào)節(jié)的細胞因子包括cx3cl1、cxcl12、cxcl10、ccl2、ccl3和ccl5等。然而,在骨癌痛大鼠中,趨化因子cxcl13和嗎啡鎮(zhèn)痛之間的作用還沒有明確的研究。目的探究在正常大鼠和骨癌痛大鼠中趨化因子cxcl13對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響,從而為骨癌痛的治療提供新的依據(jù)。方法1.walker256乳腺癌細胞的制備購自華中科技大學(xué)研究室的walker256乳腺癌細胞腹腔注射入重160~180g的清潔級sd雌性大鼠。注射后每天觀察種植癌細胞的大鼠腹部變化,待5~7天形成腹水后抽取。將抽取的腹水用d-hanks液漂洗離心至少3次,離心轉(zhuǎn)數(shù)600r/min,每次離心5min。所得癌細胞放于冰塊上備用。2.實驗動物清潔級的sd雌性大鼠購自鄭州大學(xué)動物實驗中心,重約180~220g。喂養(yǎng)環(huán)境室溫在24±0.5°c,晝夜各12小時,自由飲食。3.動物實驗分組骨癌痛模型建立:雌性清潔級sd大鼠24只,重約180~220g,隨機分為3組分別為正常組、假手術(shù)組、骨癌痛組。分別測定3組建模后0、1、3、5、7、10、14、21天大鼠的機械縮足閾值。cxcl13蛋白的表達:雌性清潔級sd大鼠24只,重約180~220g,隨機分為2組分別為假手術(shù)組和骨癌痛組,用免疫印跡技術(shù)測定大鼠0、7、14、21天時大鼠cxcl13蛋白的表達水平。cxcl13對正常大鼠的作用:雌性清潔級sd大鼠24只,重約180~220g,隨機分為4組,分別為鹽水組、嗎啡組、cxcl13重組蛋白組、cxcl13重組蛋白+嗎啡組,鞘內(nèi)給藥后,分別測定給藥前、給藥后15min、30min、60min、90min和120min時大鼠機械縮足閾值的變化情況。cxcl13在骨癌痛大鼠中對嗎啡鎮(zhèn)痛作用的影響:同正常大鼠。4.試驗藥物及其給藥方式μ阿片藥物受體激動劑,嗎啡購自中國東北制藥集團公司。大鼠cxcl13重組蛋白購自美國的派普泰克公司。所有的藥物均是鞘內(nèi)給藥,將pe-10管置入脊髓蛛網(wǎng)膜下腰膨大部位,給藥體積為10ul。5.骨癌痛模型的制備根據(jù)既往骨癌痛模型的建立的報道,大鼠骨癌痛模型的建立采用購自華中科技大學(xué)研究室的walker乳腺癌細胞(10ul4x106細胞/毫升)種植在大鼠近脛骨段的骨髓腔里。6.鞘內(nèi)置管與骨癌痛大鼠模型麻醉方式相同,按既往報道將pe-10導(dǎo)管置于大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔腰膨大的位置。7.行為學(xué)測試將大鼠放于帶有金屬絲網(wǎng)格的玻璃籠子里,測試前放置金屬絲網(wǎng)中30min。用vonfrey細絲測試所有大鼠的足趾的機械縮足閾值(mwt)。每次測試持續(xù)5s,每只大鼠重復(fù)測試5次,每次間隔10min。8.免疫印跡實驗用蛋白免疫印跡的發(fā)法檢測骨癌痛大鼠和正常組大鼠在0、7、14、21天時cxcl13蛋白和其受體cxcr5的表達。結(jié)果1.與正常組和sham組相比,骨癌痛組在1、3、5、7、10、14、21天時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。正常組和sham組相比,各個時間點的mwt值均無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。骨癌痛大鼠中各個時間點中與第0天相比第3、5、7、10、14、21時MWT值差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),特別是14天時,MWT的值最低,說明骨癌痛模型建立成功。2.用蛋白免疫印跡實驗檢測骨癌痛組和假手術(shù)組中CXCL13蛋白和其受體CXCR5的表達水平。與sham組相比,骨癌痛大鼠在建模后7、14、21天中的CXCL13和CXCR5的表達量增加,差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。建模后14天時CXCL13和CXCR5蛋白的表達量最多,與骨癌痛大鼠MWT值相一致,說明骨癌痛大鼠中CXCL13的表達增加使大鼠的MWT值降低。3.正常大鼠中,與鹽水組相比,嗎啡組大鼠的MWT值明顯上升(P0.05),CXCL13重組蛋白組大鼠的MWT值明顯下降(P0.05)。與嗎啡組相比,CXCL13重組蛋白+嗎啡組的MWT值下降(P0.05)。說明CXCL13對正常大鼠具有致痛作用并且減弱嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。4.骨癌痛大鼠中,與鹽水組相比,CXCL13重組蛋白組在60min時MWT值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),嗎啡組MWT值各個時間點均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)且MWT值均升高。與單純嗎啡組相比,CXCL13重組蛋白+嗎啡混合物組的MWT值在30min、60min時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。進一步說明在骨癌痛大鼠中CXCL13對嗎啡的鎮(zhèn)痛具有負性調(diào)節(jié)作用。結(jié)論趨化因子CXCL13具有致痛作用,在骨癌痛大鼠中其表達的上調(diào)減弱嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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本文編號：1605908