本文選題：RyR2　切入點：piggyBac　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：蘭尼堿受體(Ryanodine receptors,RyRs)是位于細胞肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum,SR)上的鈣釋放通道,由四個亞基組成,分子量約565 KD。根據(jù)編碼基因的不同可分為RyR1、RyR2和RyR3三個亞型,其中RyR2主要分布于心臟組織,通過Ca~(2+)誘導(dǎo)的Ca~(2+)釋放(Ca~(2+)induced Ca~(2+)release,CICR)機制參與心臟的興奮收縮偶聯(lián)。RyR2對心臟維持正常的生理活動至關(guān)重要,其功能異常會引起Ca~(2+)調(diào)節(jié)紊亂而導(dǎo)致心律失常、心力衰竭等多種心臟疾病。轉(zhuǎn)基因動物模型可以為發(fā)現(xiàn)和評價人類疾病提供有利的工具,小鼠與人的基因組相似程度高,繁殖周期短,是最常用的模式動物。在小鼠體內(nèi)通過轉(zhuǎn)基因、基因誘變等改變相關(guān)功能基因的序列和結(jié)構(gòu),可以用來制備人類疾病的動物模型,探索疾病發(fā)生的機制,開發(fā)疾病相關(guān)的治療藥物等。轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動的DNA序列,可作為一種轉(zhuǎn)基因載體廣泛應(yīng)用于基因功能研究中。piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子是近年來發(fā)現(xiàn)的可在小鼠體內(nèi)高效轉(zhuǎn)座的哺乳動物基因工程工具,具有轉(zhuǎn)座活性高、負載容量大、切除后無痕和長期穩(wěn)定遺傳等多種優(yōu)勢,基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)培育出基因突變的轉(zhuǎn)座鼠(PBmice)。作為體內(nèi)重要的細胞內(nèi)Ca~(2+)釋放通道,本研究我們將采用復(fù)旦大學(xué)成功構(gòu)建的PBmice,探討PB插入突變對RyR2自身功能以及小鼠體內(nèi)生物學(xué)特性的影響。本課題第一部分,我們首先從復(fù)旦大學(xué)PB突變信息數(shù)據(jù)庫(PiggyBac Mutagenesis Information Center,http://idm.fudan.edu.cn/PBmice/)中篩選并引進了piggyBac轉(zhuǎn)座RyR2基因雜合小鼠(RyR2-PBmice)。轉(zhuǎn)座子插入突變小鼠表現(xiàn)為純合子宮內(nèi)死亡而雜合子生長狀態(tài)良好,說明PB轉(zhuǎn)座子的插入可以引起RyR2基因功能丟失或異常,同時也反映了RyR2基因功能對小鼠生命過程維持的重要性。通過轉(zhuǎn)座元件攜帶的紅色熒光蛋白(Red Fluoresent Protein,RFP)追蹤和PCR測定,我們成功鑒定了RyR2-PBmice。通過對小鼠的生長狀態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)該RyR2-PBmice可穩(wěn)定遺傳,其外觀表型與野生型小鼠(WTmice)并無明顯差別。由于PB轉(zhuǎn)座元件中帶有RFP的融合序列,因此我們采用激光掃描共聚焦顯微鏡一方面檢測RFP分布,同時利用免疫熒光技術(shù)監(jiān)測RyR2在體內(nèi)的分布情況。研究發(fā)現(xiàn)RyR2主要表達于心臟、骨骼肌、平滑肌和腦組織中,RFP與RyR2的表達分布基本一致。與WTmice相比,RyR2-PBmice中RyR2的表達水平未見明顯的差異。為進一步驗證轉(zhuǎn)座后RyR2的表達變化,我們對RyR2-PBmice和WTmice心臟組織進行了RT-PCR和Western Blot實驗分別從mRNA和蛋白水平進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RyR2-PBmice心臟組織中RyR2的mRNA水平比WTmice顯著降低,但Western Blot研究表明RyR2的表達量與野生小鼠相比未見顯著性差異。說明RyR2-PBmice通過轉(zhuǎn)錄后修飾維持了與WTmice相當?shù)腞yR2表達水平,這可能是RyR2-PBmice可以維持正常心臟興奮收縮偶聯(lián)以及正常生長狀態(tài)的重要原因。RYR2作為心肌細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)Ca~(2+)釋放通道,是維系心肌細胞ca2+穩(wěn)態(tài)與心臟正常興奮收縮偶聯(lián)過程,以及心臟正常收縮與舒張功能的關(guān)鍵蛋白。因此,在本課題的第二部分研究中,我們首先研究了piggybac轉(zhuǎn)座插入ryr2基因?qū)yr2-pbmice心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響。異氟醚麻醉下監(jiān)測ryr2-pbmice和wtmice心電圖發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)狀態(tài)和注射腎上腺素和咖啡因狀態(tài)下,兩組小鼠的心電圖沒有明顯差異,說明ryr2-pbmice并不會影響到小鼠在基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下的心臟功能。進一步通過激光掃描共聚焦顯微鏡測定咖啡因刺激后小鼠心肌細胞的肌漿網(wǎng)ca2+容量,發(fā)現(xiàn)ryr2-pbmice心肌細胞肌漿網(wǎng)ca2+容量明顯減小,這提示ryr2-pbmice對心肌細胞ca2+穩(wěn)態(tài)仍然存在一定的影響。組織病理學(xué)和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)ryr2-pbmice心肌組織內(nèi)線粒體嵴大量斷裂、溶解,并且線粒體膜結(jié)構(gòu)不完整。線粒體功能研究則發(fā)現(xiàn)ryr2-pbmice心肌線粒體膜電位下降,atp含量明顯降低。這些結(jié)果提示piggybac轉(zhuǎn)座插入ryr2基因嚴重影響了小鼠心肌線粒體的結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致能量代謝障礙。為進一步分析piggybac轉(zhuǎn)座插入ryr2基因?qū)π∈笮呐K,尤其是心臟線粒體結(jié)構(gòu)和功能影響的作用機制,我們對比研究了ryr2-pbmice和wtmice兩組小鼠心臟組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)并篩選出部分與ryr2以及線粒體功能密切相關(guān)的信號通路差異蛋白,并利用rt-pcr和westernblot進行了進一步的驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過調(diào)節(jié)pka激活ryr2的小g蛋白,線粒體編碼的細胞色素c氧化酶,線粒體呼吸鏈相關(guān)的解耦聯(lián)蛋白ucp以及線粒體鈣攝取蛋白均出現(xiàn)明顯下調(diào),進一步說明了piggybac轉(zhuǎn)座插入ryr2基因?qū)π∈笮呐Kryr2功能以及心肌細胞線粒體的結(jié)構(gòu)功能具有顯著的影響。引人注意的是,我們在RYR2-PBmice活檢時發(fā)現(xiàn)其胰臟組織呈現(xiàn)比其他所有臟器都要明顯的粉紅色,并且與周圍組織的界限非常明顯。結(jié)合ryr2在胰島素分泌和葡萄糖體內(nèi)平衡方面發(fā)揮重要作用的文獻報道,我們在第三部分針對ryr2-pbmice胰臟結(jié)構(gòu)與功能的影響進行了專門研究。我們認為,ryr2-pbmice胰臟紅色顆粒物沉著可能是piggybac轉(zhuǎn)座子攜帶的紅色熒光蛋白富集所致。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,胰臟中線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變,與心肌線粒體結(jié)構(gòu)變化類似。胰臟功能研究方面,我們對比進行了ryr2-pbmice和wtmice的葡萄糖耐受實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)條件下兩組小鼠血清葡萄糖濃度和胰島素水平接近;當葡萄糖刺激后,ryr2-pbmice葡萄糖和胰島素濃度與wtmice相比均出現(xiàn)顯著性差異,說明ryr2-pbmice的胰島耐受能力受到明顯損害。免疫印跡結(jié)果表明ryr2-pbmice胰臟組織中線粒體呼吸功能相關(guān)蛋白如細胞色素c氧化酶、解耦聯(lián)蛋白ucp表達量顯著下降,而直接參與葡萄糖轉(zhuǎn)運的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白glut-4與wtmice中表達量接近。提示piggybac轉(zhuǎn)座插入ryr2基因不直接影響胰臟組織的葡萄糖轉(zhuǎn)運,而是通過影響線粒體呼吸鏈導(dǎo)致能量代謝障礙,從而影響胰臟組織的胰島素分泌和體內(nèi)葡萄糖代謝調(diào)節(jié)的過程�？傊�,通過攜帶有RFP的piggyBac轉(zhuǎn)座子插入RyR2基因成功建立了雜合小鼠RyR2-PBmice的動物模型。雖然沒有發(fā)現(xiàn)RyR2-PBmice存在心臟功能異常表現(xiàn),但仍然發(fā)現(xiàn)其心肌細胞肌漿網(wǎng)Ca~(2+)容量下降,線粒體結(jié)構(gòu)異常,線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白表達明顯下調(diào),說明piggyBac轉(zhuǎn)座插入RyR2基因破壞了小鼠的線粒體能量代謝過程。胰腺組織發(fā)現(xiàn)大量的RFP沉積,并且RyR2-PBmice的胰島素分泌和血糖調(diào)節(jié)耐受能力下降。與心臟結(jié)構(gòu)與功能研究類似,RyR2-PBmice胰腺組織的線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白同樣表達量下降,推測piggyBac轉(zhuǎn)座插入RyR2基因可能通過影響線粒體能量代謝導(dǎo)致了胰島素分泌功能的下降。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R3416

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1 王倩倩;RyR2-PBmice鑒定及RyR2基因轉(zhuǎn)座子插入突變對小鼠心臟和胰臟功能的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

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本文編號：1599090