本文選題：多囊卵巢綜合征　切入點(diǎn)：胰島素抵抗　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：觀察穴位埋線對(duì)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗(PCOS-IR)模型大鼠生殖內(nèi)分泌和胰島素抵抗的影響,從miRNA調(diào)控生殖內(nèi)分泌和胰島素信號(hào)通路探討穴位埋線治療PCOS的作用機(jī)理。本研究包括文獻(xiàn)研究和實(shí)驗(yàn)研究兩部分,首先從文獻(xiàn)研究角度論述了多囊卵巢綜合征胰島素抵抗的研究進(jìn)展,再從實(shí)驗(yàn)研究角度對(duì)穴位埋線干預(yù)PCOS-IR模型大鼠的療效及作用機(jī)制進(jìn)行了較為深入的研究。方法：1文獻(xiàn)研究全面檢索近年來與PCOS-IR有關(guān)的國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,并進(jìn)行較為系統(tǒng)的總結(jié)和綜述,進(jìn)而掌握了有關(guān)PCOS-IR研究及穴位埋線研究的前沿動(dòng)態(tài)。主要包括以下3個(gè)方面：(1)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗的研究進(jìn)展；(2)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗動(dòng)物模型的研究進(jìn)展：(3)針灸改善多囊卵巢綜合征胰島素抵抗的研究進(jìn)展。2實(shí)驗(yàn)研究(1)來曲唑配合高脂膳食誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征胰島素抵抗(PCOS-IR)大鼠模型：將24只3w齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組：PCOS-IR組(6只),PCOS組(6只),高脂組(6只)和對(duì)照組(6只),PCOS-IR組予高脂飼料喂養(yǎng)12w,第6w齡時(shí)開始每日灌胃來曲唑CMC-Na溶液,連續(xù)9w；PCOS組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12w,第6w齡時(shí)開始每日灌胃來曲唑CMC-Na溶液,連續(xù)9w；高脂組予高脂飼料喂養(yǎng)12w,第6w齡時(shí)開始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液,連續(xù)9w；對(duì)照組常規(guī)飼料喂養(yǎng)12w,第6w齡時(shí)開始每日灌胃0.5%CMC-Na溶液,連續(xù)9w。觀察大鼠體重、動(dòng)情周期、卵巢組織學(xué)變化,測定血清性激素、血脂水平、糖耐量、胰島素耐量、空腹血糖(FPG)和空腹胰島素(FINS)濃度,并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。(2) PCOS-IR模型大鼠卵巢組織miRNA差異表達(dá)譜分析研究：隨機(jī)從PCOS-IR模型組及正常對(duì)照組中各選取3只大鼠,2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下取一側(cè)卵巢,液氮冷凍保存,由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供芯片篩選差異microRNAs實(shí)驗(yàn)服務(wù)；根據(jù)基因芯片篩選結(jié)果并進(jìn)一步采用目前常用的比較公認(rèn)的9款miRNA靶基因預(yù)測軟件:DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22以及TargetScan進(jìn)行靶基因預(yù)測,選擇同時(shí)被上述數(shù)據(jù)庫中3個(gè)或3個(gè)以上數(shù)據(jù)庫預(yù)測為陽性的靶基因,結(jié)合靶基因預(yù)測結(jié)果,選擇與PCOS生殖內(nèi)分泌紊亂及胰島素抵抗相關(guān)的miR-598和miR-125b進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證。(3)穴位埋線對(duì)PCOS-IR模型大鼠miR-125b調(diào)控生殖內(nèi)分泌和胰島素抵抗的影響：PCOS-IR模型大鼠隨機(jī)分為穴位埋線組(n=8)、假穴位埋線組(假埋線組,n=6)、模型對(duì)照組(n=6)、和二甲雙胍組(n=8),另設(shè)空白對(duì)照組(n=6)。穴位埋線組于105日齡起行穴位埋線治療(穴位處方一：關(guān)元、三陰交(雙);穴位處方二：腎俞9雙)、脾俞9雙)、肝俞9雙)),穴位埋線每5天1次,兩組穴位交替,共治療20天),假穴位埋線組大鼠給予埋線組相同的抓取、乙醚麻醉、固定、穴位剪毛、消毒,選穴及埋線操作同穴位埋線組,但埋線針管中不放置羊腸線,即穴位內(nèi)不植入羊腸線；模型組：大鼠給予埋線組相同的抓取、固定、穴位剪毛、消毒,不做其他任何治療；空白對(duì)照組：大鼠給予埋線組相同的抓取、固定、穴位剪毛、消毒,不做其他任何治療；二甲雙胍組：二甲雙胍片搗碎溶解于雙蒸水中,灌胃前搖勻,大鼠每天灌胃給藥(劑量200mg/kg. d),連續(xù)治療20天。各組大鼠治療后觀察體重、體長、Lee's指數(shù)、卵巢組織學(xué)變化,放射免疫分析方法檢測血清性激素水平、血脂水平、糖耐量、胰島素耐量、空腹血糖(FPG)和空腹胰島素(FINS)濃度并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR), real-time PCR檢測卵巢組織miR-125b, FSHR、LHR、P450c17a、INSR、ERK1、ERK2mRNA表達(dá),western blot檢測大鼠卵巢組織INSR、ERK1、ERK2蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平。結(jié)果：(1)PCOS-IR組與PCOS組大鼠陰道涂片HE染色鏡檢結(jié)果顯示均處于動(dòng)情間期時(shí)相,僅見大量白細(xì)胞,偶見少量角化細(xì)胞,提示無排卵；高脂組、對(duì)照組仍保持規(guī)律的動(dòng)情周期;PCOS-IR組和PCOS組卵巢呈多囊樣改變,卵巢閉鎖卵泡增多,閉鎖卵泡的直徑較大,顆粒細(xì)胞層數(shù)有所減少,白膜增厚,無成熟卵泡,未見黃體分布；高脂組及對(duì)照組卵巢分布有各級(jí)卵泡,可見較多黃體分布；與對(duì)照組相比,PCOS-IR組大鼠的血清睪酮(T)水平顯著升高(P0.01)、黃體生成素(LH)水平明顯升高(P0.05)、卵泡刺激素(FSH)水平明顯下降(P0.05)、泌乳素(PRL)水平顯著升高(P0.01),雌二醇(E2)水平明顯下降(P0.05)、孕酮(P)水平顯著下降(P0.001),體重顯著增加(P0.001),血清總膽固醇(TC)水平明顯升高(P0.05)、低密度脂蛋白(LDL)顯著升高(P0.01),糖耐量曲線下面積(AUC)顯著增加(P0.05),胰島素耐量AUC顯著增加(P0.01),血清空腹胰島素(FINS)水平顯著升高(P0.05),胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)顯著升高(P0.05)。(2) PCOS-IR模型組和對(duì)照組卵巢組織中Fold Change值1.5,P0.05的差異表達(dá)miRNA 共 20個(gè),14個(gè)miRNA在PCOS-IR模型組中上調(diào)、6個(gè)miRNA下調(diào)。其中上調(diào)最顯著的是rno-miR-3585-5p、rno-miR-509-5p、rno-miR-218a-5p、 rno-miR-598-3p(以下簡稱miR-598)等,分別上調(diào)702.0倍、342.8倍、273.2倍及232.1倍,而下調(diào)差異最顯著的分別rno-miR-31a-5p、rno-miR-185-5p、 rno-miR-126a-3p、rno-mir-125b-5p(以下簡稱miR-125b)等,分別下調(diào)1090.2倍、3.0倍、2.3倍及1.6倍。靶基因預(yù)測顯示上調(diào)miRNA預(yù)測到7869個(gè)靶基因,下調(diào)miRNA預(yù)測到4779個(gè)靶基因,其中與PCOS生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及胰島素抵抗相關(guān)的miR-598和miR-125b通過real-time PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示：PCOS-IR模型組miR-125b表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組的表達(dá)量與芯片結(jié)果相當(dāng),表明芯片結(jié)果是可靠的,miR-125b參與PCOS-IR的發(fā)生；而miR-598定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果趨勢(shì)相反。(3)穴位埋線組、二甲雙胍組大鼠治療后卵巢形態(tài)學(xué)鏡檢可見不同發(fā)育階段的卵泡及多個(gè)黃體,大鼠恢復(fù)排卵、卵泡發(fā)育正常,假穴位埋線組與模型組大鼠卵巢囊狀卵泡和閉鎖卵泡增多,卵巢呈多囊樣改變,顆粒細(xì)胞層數(shù)減少,白膜增厚,無成熟卵泡,無黃體和白體分布；與假穴位埋線組相比,穴位埋線組大鼠治療后血清LH水平明顯降低(P0.05)、T水平顯著降低(P0.01)、PRL水平顯著降低(P0.01)、FSH水平顯著升高(P0.01)、E2水平顯著升高(P0.01)、P水平明顯升高(P0.05)；與假穴位埋線組相比,穴位埋線組大鼠治療后卵巢miR-125b表達(dá)量顯著提高(P0.001)、FSHRmRNA表達(dá)量顯著降低(P0.001)、LHRmRNA表達(dá)量顯著降低(P0.001)、P450c17 α mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.01)；miR-125b的表達(dá)量與FSHR、LHR、P450c17αmRNA表達(dá)量成負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.814、-0.826、-0.823(P值均0.001)。(4)與假穴位埋線組、模型對(duì)照組相比,穴位埋線組及二甲雙胍組治療后大鼠體重增加速度明顯減緩(P0.01),Lee's指數(shù)明顯降低(P0.001)；血清FINS及HOMA-IR顯著降低(P0.01)、糖耐量曲線下面積明顯降低(P0.05);血清總膽固醇水平顯著降低(P0.01),血清低密度脂蛋白顯著降低(P0.01),穴位埋線組與二甲雙胍治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與假穴位埋線組相比,穴位埋線組治療后,大鼠卵巢組織miR-125b表達(dá)量顯著提高(P0.001)、ERK1mRNA表達(dá)量明顯降低(P0.01)、ERK2mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.001)。miR-125b的表達(dá)量與ERK1、ERK2mRNA表達(dá)量成負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.850、-0.689(P值均0.001),miR-125b的表達(dá)量與INSRmRNA表達(dá)量無顯著相關(guān)；與假穴位埋線組相比,穴位埋線組治療后,大鼠卵巢組織INSR蛋白表達(dá)無顯著改變,但I(xiàn)NSR磷酸化比例明顯升高(P0.01),ERKl、ERK2蛋白表達(dá)下調(diào)(P0.001),磷酸化比例明顯降低(P0.001)。結(jié)論：(1)來曲唑灌胃配合高脂膳食喂養(yǎng)雌性SD大鼠可成功誘導(dǎo)PCOS-IR動(dòng)物模型,該模型避免了其他造模方法皮下注射或皮下埋植給藥方式對(duì)針灸療法效應(yīng)的干擾,可以作為一種適宜針灸療法研究的PCOS-IR動(dòng)物模型。(2)PCOS-IR模型大鼠卵巢組織miR-125b下調(diào)表達(dá),靶向調(diào)控FSHR、ERK、INSR和AKT等生殖內(nèi)分泌、胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因異常表達(dá),為進(jìn)一步探討穴位埋線改善PCOS-IR模型大鼠生殖內(nèi)分泌及胰島素抵抗的表觀遺傳作用機(jī)制研究提供了依據(jù)。(3)穴位埋線能夠明顯改善PCOS-IR大鼠生殖內(nèi)分泌紊亂,促進(jìn)卵泡正常發(fā)育和排卵;其機(jī)理在于穴位埋線下調(diào)PCOS-IR模型大鼠卵巢LHR和P450c17 α mRNA的表達(dá),降低雄激素水平,解除高雄激素血癥對(duì)miR-125b表達(dá)的抑制,使miR-125b表達(dá)上調(diào),miR-125b進(jìn)一步通過負(fù)調(diào)控途徑降低其靶基因FSHRmRNA表達(dá),在轉(zhuǎn)錄后水平改善卵巢對(duì)FSH的高反應(yīng),促進(jìn)卵泡正常發(fā)育。(4)穴位埋線能明顯改善PCOS-IR模型大鼠胰島素抵抗,提高卵巢miR-125b的表達(dá),miR-125b通過負(fù)向調(diào)控降低其靶基因ERK1、ERK2高表達(dá),下調(diào)MAPK/ERK通路的異�；罨�,恢復(fù)顆粒細(xì)胞增殖與凋亡的平衡,降低卵泡膜細(xì)胞過多合成雄激素,可能是穴位埋線改善PCOS胰島素抵抗進(jìn)而改善生殖內(nèi)分泌的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄后作用機(jī)制。
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本文編號(hào)：1597225