本文選題：脂肪移植　切入點(diǎn)：負(fù)壓吸引　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景脂肪移植的應(yīng)用至今已有百余年的歷史,具有來(lái)源廣泛,取材簡(jiǎn)便,低免疫原性等優(yōu)點(diǎn),目前被認(rèn)為是整形外科治療軟組織缺損最常用的手術(shù)方法。脂肪移植效果雖然明顯,但移植后脂肪常出現(xiàn)吸收、硬結(jié)、囊腫、鈣化等問(wèn)題,使得脂肪長(zhǎng)期保留率為20-70%。對(duì)移植后脂肪最終保留體積的不預(yù)測(cè)性限制了其在臨床上的應(yīng)用。近來(lái)隨著對(duì)脂肪移植研究的不斷深入,關(guān)于提高脂肪保留率,優(yōu)化脂肪移植的研究取得了一定進(jìn)展。2000年Khouri團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了利用軟組織外擴(kuò)張技術(shù)進(jìn)行非手術(shù)隆胸,近期該團(tuán)隊(duì)將該裝置命名為Brava,并成功地將Brava輔助自體脂肪移植這一新型技術(shù)應(yīng)用到單純性隆乳及乳癌術(shù)后的乳房重建。患者在脂肪移植術(shù)前攜帶Brava的頻率為10小時(shí)/天,持續(xù)4周,而術(shù)后為10小時(shí)/天,最少持續(xù)2周。研究發(fā)現(xiàn),起初移植脂肪的平均體積為346ml/側(cè),術(shù)后平均體積為266ml/側(cè),保留率顯著提高。越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)表明,利用軟組織外擴(kuò)張技術(shù)輔助脂肪移植是一種安全有效并且經(jīng)濟(jì)的新型技術(shù),為解決移植后脂肪保留率低的問(wèn)題帶來(lái)了希望。軟組織外擴(kuò)張技術(shù)的基本原理是提供負(fù)壓吸引力。目前其臨床效果已被證實(shí),但是相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究非常少�，F(xiàn)階段幾乎所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的是在脂肪移植術(shù)前應(yīng)用負(fù)壓吸引,強(qiáng)調(diào)了對(duì)受區(qū)的預(yù)擴(kuò)張能顯著增加受區(qū)細(xì)胞增殖,促進(jìn)新生血管的形成及脂肪細(xì)胞的存活,從而提高移植后脂肪的保留率。關(guān)于脂肪移植術(shù)前進(jìn)行受區(qū)預(yù)擴(kuò)張,提高保留率的研究已較為深入,然而遺憾的是,關(guān)于移植脂肪后應(yīng)用外體積擴(kuò)張的機(jī)制尚不明確。我們查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),大量體外研究表明機(jī)械力能提供力學(xué)信號(hào)刺激細(xì)胞膜上的機(jī)械敏感分子／通道,使細(xì)胞骨架變構(gòu),改變基因的轉(zhuǎn)錄,從而最終影響細(xì)胞的生物學(xué)功能如增殖、分化等。那么,負(fù)壓吸引力直接作用于游離移植后脂肪,對(duì)移植物的存活有何影響呢?目前仍缺乏令人信服的實(shí)驗(yàn)證據(jù),有幾個(gè)問(wèn)題亟待解決：(a)如何建立一個(gè)穩(wěn)定且有效的負(fù)壓吸引輔助脂肪移植的模型?(b)負(fù)壓吸引輔助脂肪移植相較單純游離脂肪移植,隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng),移植物內(nèi)再生相關(guān)細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞)來(lái)源及數(shù)量發(fā)生怎樣的動(dòng)態(tài)變化?(c)負(fù)壓吸引輔助脂肪移植最終形成的構(gòu)建物中新生脂肪細(xì)胞的來(lái)源及形態(tài)學(xué)變化如何?(d)從分子層面分析,負(fù)壓吸引對(duì)與脂肪再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)產(chǎn)生怎樣的影響?圍繞這幾個(gè)科學(xué)問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床上應(yīng)用的軟組織外擴(kuò)張系統(tǒng),設(shè)計(jì)并建立了一改良裝置用以提供三維機(jī)械力。我們的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型結(jié)合了兩個(gè)以往的模型：負(fù)壓吸引模型及脂肪互換移植模型,并提供穩(wěn)定的外負(fù)壓吸引力。利用磁共振成像技術(shù)對(duì)比觀察負(fù)壓吸引作用下的游離移植的脂肪組織與單純移植的脂肪組織的形態(tài)學(xué)變化。利用HE染色分析,免疫熒光及Western blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察不同時(shí)間點(diǎn)移植物的濕重,組織結(jié)構(gòu),細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化,從而對(duì)比兩組的移植效果。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是探討負(fù)壓吸引誘導(dǎo)移植后脂肪再生的作用機(jī)制,該研究結(jié)果為脂肪移植的臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),對(duì)指導(dǎo)軟組織外擴(kuò)張技術(shù)輔助脂肪移植在臨床上的應(yīng)用有著重大的意義。目的1.對(duì)比分析負(fù)壓吸引輔助游離脂肪移植較單純游離脂肪移植,再生相關(guān)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化2.負(fù)壓吸引作用下,移植物中新生的成熟脂肪細(xì)胞的來(lái)源及形態(tài)學(xué)變化3.對(duì)比分析與再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體y (peroxisome proliferator-activated receptor, PPARy)蛋白的表達(dá)4.探索軟組織外擴(kuò)張?zhí)峁┑呢?fù)壓吸引誘導(dǎo)移植后脂肪再生可能的機(jī)制方法1.動(dòng)物模型的建立實(shí)驗(yàn)中所需動(dòng)物的來(lái)源：8周雄性C57BL/6小鼠及C57BL/6-Tg(CAG-EGFP) mice (green fluorescent protein/GFP小鼠)分別來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究所及南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。本實(shí)驗(yàn)研究中建立的負(fù)壓吸引輔助脂肪移植的動(dòng)物模型結(jié)合了負(fù)壓吸引模型及脂肪互換移植模型,方法如下：1.1脂肪互換移植模型首先用戊巴比妥鈉小鼠腹腔內(nèi)注射麻醉(50mg/kg),將8周的雄性C57BL/6小鼠腹股溝處的毛發(fā)剪短并用棉球蘸取脫毛膏,在所需部位脫毛。分離并切取皮下腹股溝脂肪瓣,約150-200mg,輕柔地切成小的顆粒狀,其大小與臨床上抽吸的脂肪組織類似。然后用攜帶14G鈍針的lml注射器,將GFP陰性即C57BL/6小鼠的腹股溝脂肪組織注射到GFP小鼠的背部皮下組織下。用此方法處理55只GFP小鼠,并將移植了脂肪組織的GFP小鼠隨機(jī)分為兩組,實(shí)驗(yàn)組為游離脂肪移植+負(fù)壓吸引,對(duì)照組為單純游離脂肪移植。所有的小鼠頸部脫臼處死,在移植后的0、1、2、4、8、12周獲取移植脂肪進(jìn)行后續(xù)觀察,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本量為5只。1.2負(fù)壓吸引模型負(fù)壓吸引裝置是由三個(gè)部分組成,即負(fù)壓泵,連接裝置,動(dòng)物固定器。負(fù)壓泵為低負(fù)壓羊水吸引器(型號(hào)：DYX-1A；負(fù)壓調(diào)節(jié)范圍：-20-0kpa;生產(chǎn)商：上海斯曼峰公司)。連接器由白色透明橡膠管組成,一端連接負(fù)壓吸引器,另一端連接一3D打印獲得的穹窿狀裝置,該裝置為無(wú)毒的光敏樹脂材料,直徑為1.5cm,容積為1.5m1。固定器為圓筒狀裝置,大小比小鼠直徑略大,裝置頂部為5×2cm大小的矩形窗口,用于連接穹窿狀裝置。實(shí)驗(yàn)中負(fù)壓大小的設(shè)置為-3kpa(約-23 mmHg),該負(fù)壓值的選擇為臨床上使用Brava的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的低值,并經(jīng)過(guò)了多次預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組小鼠脂肪移植后在固定時(shí)間段進(jìn)行負(fù)壓吸引處理,每天10小時(shí),持續(xù)4周后停止負(fù)壓吸引,與臨床上使用方法一致。兩組小鼠觀察至12周,并在上述的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材。樣本放置在4%多聚甲醛中固定24小時(shí),脫水并石蠟包埋。2.磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)對(duì)比觀察移植后脂肪組織的形態(tài)學(xué)變化利用磁共振技術(shù)掃描負(fù)壓吸引作用下小鼠背部移植脂肪區(qū)域,掃描儀為Philips Achieva 3.0T,用戊巴比妥鈉小鼠腹腔內(nèi)注射麻醉(50 mg/kg),整個(gè)過(guò)程小鼠保溫,獲得小鼠背部移植脂肪區(qū)域的薄層T1及T2加權(quán)像圖片,觀察移植后脂肪組織的固定情況。3.大體及組織學(xué)觀察用數(shù)碼相機(jī)捕捉并顯示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大體圖片,將樣本制成蠟塊后連續(xù)切片,厚度為5 u m,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行HE染色,染色結(jié)果用奧林巴斯BX51顯微鏡觀察,并用奧林巴斯DP71數(shù)碼相機(jī)拍照。通過(guò)對(duì)每張切片10個(gè)視野中血管數(shù)量的計(jì)算評(píng)估移植物中血管新生(40×),所有數(shù)據(jù)的采集及分析均由兩位觀察者獨(dú)立地雙盲進(jìn)行。4.免疫熒光觀察移植物中再生相關(guān)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化樣本切成5 μ m的石蠟薄片后進(jìn)行免疫熒光染色。免疫熒光使用的一抗如下：雞抗GFP(稀釋比例為1：200;英國(guó)劍橋Abeam公司),大鼠抗小鼠CD34(稀釋比例為1:300; Abeam公司),豚鼠抗小鼠(稀釋比例為1：400；德國(guó)海德堡progen公司),大鼠抗小鼠F4/80(稀釋比例為1:25; Abeam公司)。使用的二抗如下：Alexa Fluor 488-conjugated山羊抗雞免疫球蛋白Y(稀釋比例為1：200；澳大利亞Thermo Fisher公司),Alexa Fluor 555-conjugated驢抗大鼠免疫球蛋白G(稀釋比例為1：200；Abeam公司),Alexa Fluor 647-conjugated山羊抗豚鼠免疫球蛋白G(稀釋比例為1：200；Abeam公司)。細(xì)胞核染色用DAPI(稀釋比例為1：200；美國(guó)Sigma公司)新生微血管染色用Lectin594(稀釋比例為1：200,美國(guó)Invitrogen公司)。每張切片至少選取3個(gè)視野計(jì)算新生微血管數(shù)量。5.用Western blot技術(shù)檢測(cè)移植物中成脂分化過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子(PPAR丫蛋白)的表達(dá)為了從分子層面觀察脂肪成脂分化過(guò)程,本研究利用Western blot技術(shù)半定量分析過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ),它是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,該蛋白的表達(dá)量代表成脂分化程度。一抗為兔抗小鼠PPARγ(稀釋比例為1:500; Abcam),二抗為山羊抗兔免疫球蛋白G(稀釋比例為1：800,上海生工生物工程有限公司)。另外,3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(稀釋比例為1：5000；Bioworld技術(shù)股份有限公司)作為內(nèi)參。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有的數(shù)據(jù)應(yīng)用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,最初實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重值雖在一定范圍內(nèi),因無(wú)法人為控制,為了排除小鼠體重對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,本實(shí)驗(yàn)將小鼠的體重作為協(xié)變量,采用帶協(xié)方差的析因分析方法。小鼠的體重及移植物的標(biāo)準(zhǔn)化重量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean ± S.E)。其他數(shù)據(jù)用均數(shù)±方差表示(mean±SD),各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1. 磁共振證實(shí)移植物為脂肪組織且在負(fù)壓吸引作用下固定良好,肉眼觀察脂肪組織周圍有較多的膠凍狀滲出液。2. 移植后1、4、8、12周,負(fù)壓吸引作用下移植物標(biāo)準(zhǔn)化重量較單純性脂肪移植顯著提高。移植后12周,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組移植物標(biāo)準(zhǔn)化重量分別為0.060±0.001,0.046±0.001。3. 在負(fù)壓吸引作用下,巨噬細(xì)胞大量滲入移植物內(nèi),另外,新生微血管數(shù)量增加,移植物內(nèi)血供增加,并且細(xì)胞主要來(lái)源于宿主。4. 在負(fù)壓吸引作用下,主要再生細(xì)胞來(lái)源的CD34+間充質(zhì)干細(xì)胞由宿主向移植物內(nèi)遷移的數(shù)量增多。5. 移植后第12周,負(fù)壓吸引作用下的移植物中再生的成熟脂肪細(xì)胞一半來(lái)源于宿主,一半來(lái)源于移植物。6. 移植后第14天及28天,負(fù)壓吸引輔助脂肪移植較單純性脂肪移植,移植物中的PPARγ蛋白的表達(dá)顯著增加。結(jié)論1.本研究通過(guò)對(duì)負(fù)壓吸引輔助游離脂肪移植及單純游離脂肪移植中,移植脂肪大體組織、細(xì)胞及分子層面的對(duì)比觀察,充分證實(shí)了負(fù)壓吸引提高移植物保留率的機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)重要的再生相關(guān)細(xì)胞的遷移及浸潤(rùn),從而促進(jìn)新生血管的形成及成脂分化,最終誘導(dǎo)移植后脂肪組織再生,構(gòu)建出更為成熟的脂肪組織。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R622

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