本文選題：透明質(zhì)酸　切入點(diǎn)：透明質(zhì)酸酶　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：透明質(zhì)酸是一種高分子酸性黏多糖,廣泛存在于脊椎動(dòng)物組織細(xì)胞外基質(zhì)中。透明質(zhì)酸在炎癥、創(chuàng)傷愈合、血管再生等方面發(fā)揮重要的作用。透明質(zhì)酸分子量范圍十分廣泛。透明質(zhì)酸的生理功能與其分子量大小和在何種情況下合成密切相關(guān)。目前商品大分子量透明質(zhì)酸主要通過(guò)微生物發(fā)酵法獲得,極少數(shù)來(lái)源于動(dòng)物組織提取。低分子量透明質(zhì)酸通過(guò)物理或者化學(xué)的方法降解透明質(zhì)酸獲得。這些方法反應(yīng)條件劇烈,往往會(huì)破壞單糖的殘基結(jié)構(gòu),同時(shí)隨機(jī)降解糖苷鍵,因此無(wú)法獲得均一的透明質(zhì)酸。使用酶解法制備小分子透明質(zhì)酸,條件溫和,特異性降解糖苷鍵,可以獲得高質(zhì)量透明質(zhì)酸,因此備受人們關(guān)注。透明質(zhì)酸酶是主要降解透明質(zhì)酸的一類糖苷酶。最初作為"擴(kuò)散因子"被發(fā)現(xiàn),之后作為藥物滲透劑促進(jìn)藥物吸收、手術(shù)后水腫消散和局部麻醉效果等。除了動(dòng)物睪丸和毒液中,越來(lái)越多的微生物已被報(bào)道可以產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶。但動(dòng)物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶原料有限,微生物制備透明質(zhì)酸酶越來(lái)越受到關(guān)注。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多微生物都可以產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶,但酶的活性都普遍偏低,主要原因是產(chǎn)酶量低。本研究對(duì)菌株基因組進(jìn)行了測(cè)序,通過(guò)基因組分析獲得編碼透明質(zhì)酸酶的氨基酸序列,并使用SDS-PAGE、Native-PAGE和質(zhì)譜對(duì)此序列進(jìn)行了驗(yàn)證。并對(duì)透明質(zhì)酸酶家族的活性架構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。設(shè)計(jì)了重組載體,完成了此透明質(zhì)酸酶的外源表達(dá)和重組透明質(zhì)酸酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究。最后使用熒光輔助糖電泳法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了研究。1.菌株基因組測(cè)序和序列分析基因組測(cè)序的結(jié)果顯示菌株基因組大小為4174362 bp,含有基因4568條。經(jīng)過(guò)分析注釋獲得一條可能為編碼透明質(zhì)酸酶的基因。此基因編碼的蛋白分子量約83 kDa,等電點(diǎn)為6.55。2.電泳和質(zhì)譜對(duì)獲得的編碼序列進(jìn)行驗(yàn)證首先對(duì)培養(yǎng)48 h的野生型菌株的發(fā)酵上清液進(jìn)行超濾離心,然后進(jìn)行電泳檢測(cè)。SDS-PAGE結(jié)果顯示在83kDa附近有蛋白條帶�；钚噪娪緳z測(cè)結(jié)果表明,發(fā)酵上清液具有透明質(zhì)酸酶酶活,同時(shí)只有一條活性條帶,說(shuō)明此菌株表達(dá)且只表達(dá)一種透明質(zhì)酸酶。胞外蛋白質(zhì)譜結(jié)果分析表明有29條肽段與注釋出來(lái)的編碼序列高度匹配,說(shuō)明細(xì)菌表達(dá)了注釋基因編碼的蛋白。基因組分析獲得的基因?yàn)榫幋a透明質(zhì)酸酶的基因。3.透明質(zhì)酸酶活性架構(gòu)的生物信息學(xué)分析在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中,透明質(zhì)酸酶主要屬于GH56和PL8家族。分析活性架構(gòu)區(qū)域的序列與結(jié)構(gòu)特征對(duì)于研究透明質(zhì)酸酶的作用機(jī)理具有重要意義。本文對(duì)這兩個(gè)家族的透明質(zhì)酸酶活性架構(gòu)的氨基酸進(jìn)行了分析,并制作了活性中心序列譜。4.透明質(zhì)酸酶的外源表達(dá)和純化選取pET-28a作為載體,大腸桿菌(BL21)為工程菌。在20℃,200 rpm,1mMIPTG的條件下,構(gòu)建的表達(dá)菌株(BL21)成功表達(dá)出可溶性透明質(zhì)酸酶。使用不同濃度的咪唑洗脫液對(duì)鎳柱進(jìn)行洗脫,在100mM咪唑洗脫液洗脫時(shí)可以獲得電泳純透明質(zhì)酸酶,此酶可以用于后期研究。5.重組透明質(zhì)酸酶的酶學(xué)性質(zhì)研究(1)溫度和pH對(duì)重組HAase的影響重組透明質(zhì)酸酶最適反應(yīng)溫度為42℃,在37℃和42℃之間酶活均很高,且穩(wěn)定性較好。50℃保溫10 min,酶活僅剩約10%。重組透明質(zhì)酸酶最適pH為6.5,pH 5.5-8.0時(shí),酶的穩(wěn)定性較高,室溫放置2 h酶活依然可以保留在80%以上。當(dāng)pH大于9.0或小于4.0時(shí),重組透明質(zhì)酸酶完全失活。(2)不同濃度的NaCl和NaH_2PO_4-Na_2HPO_4緩沖液對(duì)酶活的影響當(dāng)NaH_2PO_4-Na_2HPO_4緩沖液濃度為5 mmol/L時(shí)酶活最高,但是對(duì)于酶活的提升并不明顯,僅提高約16%。但稍高一點(diǎn)的NaH2PO4-Na2HP04緩沖液對(duì)酶活產(chǎn)生了抑制效果,當(dāng)NaH_2PO_4-Na_2HPO_4緩沖液的濃度達(dá)到200 mmol/L時(shí)酶活降低到80%以下。NaCl濃度為5 mmol時(shí)酶活顯示最高,隨著濃度的增加酶活有一定下降但總的來(lái)說(shuō)添加適當(dāng)?shù)腘aCl對(duì)酶活有提升作用(最高濃度只做到了 200 mmol/L)。(3)金屬離子、EDTA及表面活性劑對(duì)酶活的影響Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)對(duì)酶活具有促進(jìn)作用;酶液中含有100mmol/LBaCl_2時(shí),酶活最高(約為168%)。10 mmol/L的Cu~(2+)和Zn~(2+)可以明顯的抑制酶的活性,其中Cu~(2+)可以使酶完全失活,Zn~(2+)則使酶活減少近80%。10 mmol/L的EDTA對(duì)酶活基本不產(chǎn)生影響,但是當(dāng)濃度增加到100mmol/L,重組透明質(zhì)酸酶的活性明顯降低,大約減少80%。非離子型表面活性劑Triton X-100的加入對(duì)酶活產(chǎn)生了一定的抑制作用,但酶活的降低并不明顯,2%Triton X-100室溫處理酶液30 min酶活仍能保留80%以上。但是離子型表面活性劑SDS在0.5%濃度下就可以使重組透明質(zhì)酸酶完全失活。(4)重組透明質(zhì)酸酶的底物特異性研究重組透明質(zhì)酸酶特異性降解透明質(zhì)酸,不能降解硫酸軟骨素、肝素和羧甲基纖維素鈉。(5)重組透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸的酶動(dòng)力學(xué)研究重組透明質(zhì)酸酶的K_m和V_(max)分別為4.985 mg/mL和0.4071 μm/mL/min。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ925

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 鐘讀波;孟慶雄;;透明質(zhì)酸酶[J];食品與藥品;2007年04期

2 錢禎觀;葉率官;陳杰;;以多功能光纖光度計(jì)測(cè)定透明質(zhì)酸酶(熒光法)[J];化學(xué)試劑;1991年05期

3 王彥;周淑敏;王淑清;寧宗超;邢艷萍;;透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究[J];黑龍江醫(yī)藥;2002年01期

4 吳劍英;陳奕涵;;透明質(zhì)酸酶的研究現(xiàn)狀及展望[J];現(xiàn)代化工;2014年05期

5 王曉玉;劉飛;張莉;朱希強(qiáng);凌沛學(xué);張?zhí)烀?;重組人透明質(zhì)酸酶3種活性測(cè)定方法的比較[J];食品與藥品;2011年01期

6 安邁瑞;韓玲;李儒仁;楊萌萌;余群力;陳騁;郭兆斌;;牛肝臟透明質(zhì)酸酶提取工藝優(yōu)化[J];食品工業(yè)科技;2013年16期

7 李丹;郭育濤;楊永利;白小花;;牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究[J];應(yīng)用化工;2011年08期

8 楊國(guó)玲;中國(guó)黑白花優(yōu)良種公牛精子透明質(zhì)酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J];蘭州大學(xué)學(xué)報(bào);1992年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前4條

1 周純;吳德義;;透明質(zhì)酸酶治療球后血腫[A];2006年浙江省眼科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

2 李培旭;李尚為;彭芝蘭;馬黔紅;黃仲英;李蕾;唐宗蓉;韓字研;;透明質(zhì)酸酶在人睪丸成熟精子分離中的應(yīng)用初探[A];第九次全國(guó)生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2003年

3 張影;全雪梅;曹云飛;秦志明;龔藝貞;莫曾南;;透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸酶診斷和監(jiān)測(cè)膀胱癌的復(fù)發(fā)中價(jià)值的Meta分析[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

4 么宏強(qiáng);張?jiān)旅?朱福余;于立新;馬學(xué)恩;;綿羊透明質(zhì)酸酶-2基因克隆載體的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析[A];2012年中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)暨中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 陸志城;透明質(zhì)酸酶注射液[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

2 陸志城;透明質(zhì)酸酶注射液：促進(jìn)注射藥物吸收[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉珊;重組長(zhǎng)效透明質(zhì)酸酶的構(gòu)建及其在皮下給藥與腫瘤治療中的應(yīng)用研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(過(guò)程工程研究所);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 薛蔚;產(chǎn)透明質(zhì)酸酶菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D];山東大學(xué);2015年

2 陳怡斐;重組透明質(zhì)酸酶的表達(dá)、純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D];上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院;2016年

3 李彥韜;CHO細(xì)胞表達(dá)的人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)與功能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

4 李帥帥;一種節(jié)桿菌來(lái)源的透明質(zhì)酸酶的研究[D];山東大學(xué);2017年

5 蘇康;噬尼古丁節(jié)桿菌產(chǎn)透明質(zhì)酸酶條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D];山東大學(xué);2014年

6 常翠榮;透明質(zhì)酸酶對(duì)眼眶成纖維細(xì)胞的作用研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

7 劉超;鳶尾苷的提取分離及其與透明質(zhì)酸酶作用研究[D];江南大學(xué);2012年

8 黃琴;透明質(zhì)酸酶對(duì)外傷性玻璃體積血轉(zhuǎn)歸影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];南昌大學(xué);2008年

9 李廷坤;透明質(zhì)酸酶和曲安奈德局部用藥對(duì)軟組織損傷性粘連的影響[D];鄭州大學(xué);2006年

10 朱其聰;幾丁糖、透明質(zhì)酸酶對(duì)多西紫杉醇外滲性大鼠皮膚損傷的療效[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

，

本文編號(hào)：1562596