本文選題：疏肝健脾法　切入點：腸激安方　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本研究在課題組前期成功制備的IBS-D大鼠模型、腸激安方制劑工藝、腸激安方治療IBS-D藥效學(xué)的基礎(chǔ)上(廣州市科技局課題：腸激安膠囊治療腹瀉型IBS產(chǎn)業(yè)化開發(fā),編號：2008A1-E4101-6；腸激安膠囊治療腹瀉型IBS臨床前開發(fā),編號：2005J1-C0201),從動物和分子生物學(xué)水平,探討疏肝健脾法調(diào)控IBS-D大鼠模型“腦-腸軸”異常的作用機制。 目的： 改進IBS-D大鼠模型,完善該模型的評價方法；探討以疏肝健脾為治則組成的腸激安方對IBS-D大鼠的淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的調(diào)控作用；探討腸激安方給藥組和模型組下丘腦和結(jié)腸組織蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜,結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定并分析差異表達蛋白,對候選表達差異蛋白進行蛋白質(zhì)功能研究,進一步闡明疏肝健脾法對IBS-D模型大鼠腦腸軸異常通路調(diào)控機制。 方法： (1) IBS-D模型的制備和評價：采用母子分離,束縛,醋酸刺激三因素法制備IBS-D大鼠模型。模型組乳鼠從第2天至第14天每天上午8點到11點將乳鼠和母鼠分離3h,然后與母鼠一起飼養(yǎng)至第22天斷奶,第30天分籠。將所有模型大鼠混合均勻,從中隨機選取雌性大鼠30只。正常組不分離,于第30天同法操作。于出生后第35天剔除體重小于120g者,隨機選擇雌性大鼠各20只,模型組每天上午給予番瀉葉水煎液按1ml/l00g大鼠灌胃,灌胃結(jié)束后立即用紙袋束縛大鼠的前肩、前上肢和胸部,限制其上肢撓抓頭面部,但不限制其活動,束縛時間1h。正常組同法給予生理鹽水灌胃,不做束縛處理。連續(xù)灌胃1周,每天1次。通過大便含水量的測定、內(nèi)臟高敏感性進行評價,常規(guī)病理組織學(xué)檢查等方法進行模型的評估。 (2)腸激安方對淋巴細胞亞群CD3+、 CD4+、CD8+的含量的影響：腸激安方高、中、低劑量組的大鼠藥效學(xué)劑量分別為2.812g生藥/kg,1.406g生藥/kg,0.703g生藥/kg。中藥飲片按常規(guī)方法制備成水煎液,大鼠藥效學(xué)劑量為16.74g/kg。將各組大鼠給予相應(yīng)的藥物,給藥體積為10ml/kg。正常對照組、模型對照組同法給蒸餾水10ml/kg。每天灌胃1次,連續(xù)灌2周。末次給藥三小時后,大鼠乙醚麻醉后眼球取血1ml置于EDTA抗凝管中,取50ul抗凝血分別加入10ul熒光素標記的單克隆抗體CD3+、CD4+、CD8+避光孵育20min,加入溶血素2ml,再避光孵育10-15分鐘,至液體澄清透明,1000rpm離心15min,棄去上清液,加入lml PBS洗液混勻,離心5min,棄去上清液,將樣品混懸于0.5ml PBS洗液中,結(jié)束后,立即取抗凝血加入熒光素標記的單克隆抗體CD3+、CD4+、CD8+上流式細胞儀進行檢測。 (3)差異蛋白的篩選：采用雙向凝膠電泳法分離IBS-D模型組和腸激安方中劑量組下丘腦和結(jié)腸組織差異蛋白,運用MALDI TOF/TOF串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進行鑒定,運用Gene Ontology將所鑒定的差異蛋白進行功能分類,分析疏肝健脾法治療IBS-D病理機制中的蛋白相互作用。 (4)使用Western Bloting法檢測腸激安方中劑量組和模型組下丘腦PRDX1蛋白和結(jié)腸組織LGALS9蛋白的表達。 結(jié)果： (1)給予番瀉葉灌胃和束縛前(第35天之前),正常組和模型組大鼠糞便含水量均較接近,無顯著性差異(P0.05)；模型組大鼠灌胃番瀉葉并進行束縛后糞便含水量激增,與正常組相比較有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；在造模結(jié)束后2周內(nèi)(第42-56天),模型組大鼠糞便含水量之間無顯著性差異(P0.05)。 (2)給予番瀉葉灌胃和束縛應(yīng)激前(第35天之前),模型組大鼠痛閾值與正常組大鼠相比,無顯著性差異(P0.05)；給予番瀉葉灌胃和束縛應(yīng)激后,模型組大鼠與正常組大鼠痛閾值存在顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),模型組大鼠痛閾值降低,提示其存在內(nèi)臟高敏感性,對外界刺激反應(yīng)較大；從第56天開始,模型組痛閾值升高,第63天模型組大鼠痛閾值與第42天模型組大鼠痛閾值前后比較有顯著性差異(P0.05) (3)結(jié)腸病理檢查：正常對照組大鼠結(jié)腸切片光鏡下結(jié)腸粘膜形態(tài)完好,上皮細胞排列整齊,縱形肌和環(huán)狀肌分界清楚,粘膜下無充血、水腫,無炎性細胞浸潤。模型對照組大鼠結(jié)腸切片光鏡下偶見上皮細胞排列不整,粘膜下輕度水腫,局部少量炎性細胞浸潤,杯狀細胞顯著增多,形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯器質(zhì)性改變。 (4)與模型組血清中CD3+相比,匹維溴銨組、腸激安方給藥組血清中CD3+無統(tǒng)計學(xué)差異,與正常組血清中CD4+相比,模型組CD4+比例明顯降低,CD8+比例明顯升高,CD4+/CD8+比值也顯著降低。與模型組相比,腸激安方CD4+、CD4+/CD8+明顯升高,CD8+明顯降低。 (5)本研究運用蛋白組學(xué)的方法尋找IBS-D模型組和腸激安方中劑量組下丘腦和結(jié)腸組織的差異表達蛋白譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸組織中,經(jīng)過生物質(zhì)譜鑒定,共得到9種蛋白,分別是：LONP1、 LTA4H、 UAP1、 ALDH2、SET2、 HADHSC、 LGALS9、 KRT19、 RPS12。與模型組比較,有8種蛋白下調(diào)：LONP1、 LTA4H、 UAP1、 ALDH2、 SET2、HADHSC、 LGALS9、 KRT19。一種蛋白上調(diào)：RPS12。在下丘腦組織中,差異倍數(shù)在2.5倍以上的蛋白共有10個,分別是：TPI1、PAFAH1B3、PRDX1、NDUFB10、 AK1、S100B. DSTNL1、 PPIA、 COX6A1、 HBB-B1。與模型組比較,給藥組有5種蛋白上調(diào)：AK1、 S100B、 DSTNL1、 PPIA、 COX6A1,5種蛋白下調(diào)：TPI1、PAFAH1B3、 PRDX1、 NDUFB10、HBB-B1。 (6)在下丘腦組織中,與模型組相比,腸激安方中劑量組大鼠下丘腦組織PRDX1蛋白表達水平顯著下降(P0.01)。在結(jié)腸組織中,與模型組相比,腸激安方中劑量組大鼠結(jié)腸組織LGALS9蛋白表達水平明顯下降(P0.05)。 結(jié)論： (1)采用母子分離、番瀉葉水煎液灌胃結(jié)合束縛應(yīng)激法可成功建立肝郁脾虛泄瀉的IBS-D大鼠模型,該模型具有內(nèi)臟超敏、腸道功能障礙、腹瀉、抑郁等多種特征,且該模型腸道組織形態(tài)無異常病變,能較好的模擬IBS-D屬于慢性功能性腸病特點。 (2)疏肝健脾法對IBS-D模型大鼠腦腸軸異常作用機制可能是與升高血清中CD4+以及CD4+/CD8+的含量、降低血清中CD8+的含量有關(guān)。 (3)疏肝健脾法對IBS-D模型大鼠腦腸軸異常通路調(diào)控可能與降低IBS-D模型大鼠下丘腦PRDX1蛋白和降低結(jié)腸組織LGALS9蛋白的表達有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：1561793