本文關(guān)鍵詞： 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 狼瘡腎炎 高遷移率族蛋白1 BXSB鼠 Caspase-1　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 高遷移率族蛋白1(High-mobility group box1,HMGB1)作為一種高度保守的蛋白質(zhì)先前被認(rèn)為是一種DNA結(jié)合蛋白,參與維護(hù)核小體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。首次發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是一種染色體蛋白質(zhì),后來認(rèn)為在神經(jīng)元細(xì)胞以膜結(jié)合形式存在,被稱為“二性霉素B”。細(xì)胞內(nèi)的HMGB1可以由活化的細(xì)胞主動(dòng)分泌、或凋亡細(xì)胞等被動(dòng)釋放至細(xì)胞外。最近研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞外的HMGB1是一種有效的促炎細(xì)胞因子,能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和黏附分子,招募炎癥細(xì)胞至損傷部位,參與許多炎性疾病,如腸道炎性疾病、腫瘤和風(fēng)濕性疾病。同時(shí)HMGB1還是樹突狀細(xì)胞成熟和Thl細(xì)胞極化過程中的一個(gè)調(diào)節(jié)因子, HMGB1在細(xì)胞外可誘導(dǎo)TNF-a、IL-1、IL-6及多種粘附分子如VCAM-1和MCP-1的表達(dá),同時(shí)HMGB1對(duì)于維持Th1/Th2細(xì)胞因子之間的平衡也有著重要作用。除了直接的致炎和刺激免疫的作用,HMGB1還可以作為一種內(nèi)源性的免疫佐劑,通過誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)和干擾凋亡細(xì)胞的清除來促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。以往的研究已經(jīng)證實(shí),HMGB1和多種自身免疫性疾病相關(guān),并已成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)。 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種典型的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,以一種多因素參與、多種自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物沉積、多個(gè)臟器受累為疾病特點(diǎn)。SLE的自身抗體是以針對(duì)細(xì)胞核成分為主的,并且這些自身抗體的存在于許多臨床表現(xiàn)相關(guān),其中狼瘡腎炎(Lupus nephritis,LN)是SLE最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,與病情發(fā)展和死亡率密切有關(guān)。雖然在過去的幾十年里藥物治療效果有顯著提高,但是,發(fā)展為終末期腎病的高風(fēng)險(xiǎn),加上藥物的副作用大,促使我們尋找更有效并且毒副作用更小的藥物來治療LN。SLE和LN的發(fā)病機(jī)制及藥物治療長(zhǎng)期以來就是風(fēng)濕免疫研究領(lǐng)域的難點(diǎn)。因此研究SLE和LN的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療措施,對(duì)于改善患者生存質(zhì)量,具有十分重要的意義。 免疫調(diào)節(jié)異常在SLE的發(fā)病過程中起著主導(dǎo)作用,其中包括免疫細(xì)胞功能異常、多種細(xì)胞因子表達(dá)異常。另外,SLE典型的血清學(xué)特征是大量自身抗體的產(chǎn)生,尤其是針對(duì)各種自身組織成分的抗體,包括抗核小體抗體和抗DNA抗體。有人提出,凋亡細(xì)胞是自身抗原的來源。SLE患者由于清除機(jī)制缺陷,導(dǎo)致凋亡細(xì)胞不斷積累成為晚期凋亡細(xì)胞甚至二級(jí)壞死細(xì)胞。研究表明,HMGB1與核小體從凋亡細(xì)胞釋放有關(guān),并且HMGB1可以提高核小體的免疫刺激作用。此外,研究發(fā)現(xiàn),SLE患者的血清中核小體以及HMGB1水平顯著升高,HMGB1被認(rèn)為是組成DNA免疫復(fù)合物的成分之一。然而,HMGB1在SLE的病理生理學(xué)的作用方式尚不清楚。SLE患者血清中升高的DNA免疫復(fù)合物濃度等數(shù)據(jù)證明,HMGB1與RAGE通過激活漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)DNA的抗體從而導(dǎo)致自身免疫的發(fā)生。此外,HMGB1能夠激活B細(xì)胞。已經(jīng)在SLE患者血清中檢測(cè)到]HIMGB1和抗HMGB1抗體水平升高,因此HMGB1被認(rèn)定是一種新的自身抗原。有關(guān)HMGB1與SLE的發(fā)病關(guān)系國外雖已有少量研究報(bào)道,但研究結(jié)果不盡相同。HMGB1在SLE中的作用機(jī)制尚不清楚,抑制HMGB1是否可以對(duì)SLE疾病產(chǎn)生影響?HMGB1是否可以作為SLE治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)? 目的： 利用BXSB狼瘡小鼠模型,應(yīng)用HMGB1單克隆抗體(HMGB1mAb)抑制HMGB1的作用,通過抑制HMGB1對(duì)BXSB狼瘡小鼠模型疾病表現(xiàn)的影響,探討HMGB1在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用、HMGB1可能作為治療SLE的治療選擇及其基本的作用機(jī)制,為SLE的治療提供新的治療策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 以24只16周齡雄性BXSB狼瘡小鼠為研究對(duì)象,隨機(jī)分為2組,HMGB1mAb實(shí)驗(yàn)組和IgG對(duì)照組,每組12只。HMGB1mAb實(shí)驗(yàn)組小鼠用中和性抗HMGB1單克隆抗體(HMGB1mAb)進(jìn)行處理,從16周齡到26周齡(共10周)每周三次腹腔內(nèi)注射抗HMGB1抗體(10μ g/鼠)。IgG對(duì)照組BXSB狼瘡小鼠從16周齡到26周齡每周三次給予腹腔內(nèi)注射相同劑量的Ig(10μg/鼠)。于實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)0周、2、4、6、8、10周末分別收集各組小鼠24小時(shí)尿液。離心去沉渣,-20℃保存待檢。尿蛋白濃度用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè),尿肌酐濃度檢測(cè)用Beckman全自動(dòng)生化儀檢測(cè),計(jì)算尿蛋白/肌酐比率。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死小鼠后取出脾臟標(biāo)本以電子稱稱重,利用脾臟指數(shù)(SI)衡量脾腫大,(SI=(脾臟重量/體重)×1000)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),乙醚麻醉小鼠,斷頭取血,離心分離血清,采用ELISA法測(cè)定血清抗dsDNA抗體和循環(huán)IgG水平,三重測(cè)定0D490的方法來記錄血清值,抗ds-DNA抗體和循環(huán)IgG水平記錄單位為U/ml,陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)值來自于混合的發(fā)病BXSB小鼠血清。取小鼠腎臟標(biāo)本,切取一側(cè)腎皮質(zhì)置于10%福爾馬林緩沖溶液固定2小時(shí)后脫水,石蠟包埋,組織切片經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后進(jìn)行腎臟組織病理學(xué)觀察,用ImageJ(ImageJ NIH)進(jìn)行圖像分析。我們通過檢查20個(gè)腎小球橫截面(GCS)來評(píng)估腎小球病理變化,進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分；切取另一側(cè)腎皮質(zhì),迅速置于液氮中快速冰凍,用熒光素標(biāo)記抗鼠IgG和抗鼠C3染色,熒光顯微照片評(píng)價(jià)免疫熒光的強(qiáng)度和范圍。采用流式細(xì)胞微球陣列(CBA)技術(shù),利用Mouse Inflammation Cytometric Bead Array試劑盒和FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀測(cè)定BXSB狼瘡小鼠外周血血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、 IL-6、 IL-17、IL-18和IFNα水平。提取小鼠腎臟組織蛋白,用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度,采用分光光度法檢測(cè)組織裂解液中Caspase-1活性。0D405值升高表示Caspase-1活性增加。采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。組間比較采用了未配對(duì)的雙尾Student t檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。p0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.HMGB1mAb可以減輕BXSB狼瘡小鼠的尿蛋白水平、尿蛋白/肌酐比率和脾臟腫大。兩組小鼠從16周齡開始出現(xiàn)蛋白尿。HMGB1mAb治療組的小鼠從治療8周后蛋白尿較IgG對(duì)照組下降,并且HMGB1mAb治療組的尿蛋白/肌酐比率較IgG對(duì)照組小鼠下降(p0.01)。通過脾重指數(shù)SI顯示,HMGB1mAb治療組的BXSB小鼠的脾臟腫大較IgG對(duì)照組明顯減輕(p0.01)。 2.HMGB1mAb可以降低BXSB狼瘡小鼠血清抗dsDNA抗體和循環(huán)IgG水平。IgG對(duì)照組小鼠在26周齡時(shí)血清抗dsDNA抗體水平顯著升高,而在HMGB1mAb治療組這一升高被明顯抑制(p0.01)。HMGB1mAb治療組在26周齡時(shí)與工gG對(duì)照組相比,血清循環(huán)IgG水平顯著降低(p0.01)。 3. HMGB1mAb可以減輕BXSB狼瘡小鼠腎臟病理學(xué)表現(xiàn)和免疫復(fù)合物沉積。對(duì)HE染色腎組織學(xué)評(píng)分來評(píng)估腎小球炎癥程度,IgG對(duì)照組BXSB狼瘡鼠表現(xiàn)出狼瘡樣彌漫性腎小球腎炎,而HMGB1mAb治療組小鼠腎臟表現(xiàn)為腎小球病理組織學(xué)顯著改善(p0.01)。HMGB1mAb治療組BXSB狼瘡鼠較IgG對(duì)照組相比,腎小球IgG和補(bǔ)體C3沉積顯著減少(p0.01)。 4.HMGB1mAb降低了BXSB狼瘡小鼠外周血血清炎癥細(xì)胞因子水平。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取HMGB1mAb治療組和對(duì)照組BXSB狼瘡鼠的外周血清。HMGB1mAb治療組小鼠血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18和IFNα水平較IgG對(duì)照組均顯著降低(p0.01)。 5. HMGB1mAb降低了BXSB狼瘡小鼠腎臟Caspase-1活性。HMGB1mAb治療組小鼠腎臟Caspase-1活性顯著降低,與IgG對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。 結(jié)論： HMGB1mAb可以明顯改善BXSB小鼠的臨床和組織學(xué)表現(xiàn),表現(xiàn)為尿蛋白／肌酐比率下降、脾腫大減輕、血清抗ds-DNA抗體水平和循環(huán)免疫復(fù)合物水平下調(diào)、腎臟病理學(xué)改變及免疫沉積方面均有明顯改善。HMGB1mAb對(duì)BXSB小鼠發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能有：抑制自身免疫和炎癥反應(yīng)體系,減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生并抑偉Caspase-1活性；抑制抗dsDNA抗體和循環(huán)免疫復(fù)合物形成,在免疫復(fù)合物的存在中起功能性作用。在SLE中,HMGB1是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn),抑制]HMGB1可以延緩狼瘡病情發(fā)展。本研究為臨床上以HMGB1為靶點(diǎn)而治療SLE和LN提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R593.241

【共引文獻(xiàn)】

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