本文關(guān)鍵詞： ACE2 剪切力 內(nèi)皮細(xì)胞 動(dòng)脈粥樣硬化 剪切力 內(nèi)皮細(xì)胞 ACE2 KLF2 AMPK　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用研究背景心腦血管疾病已成為危害人類(lèi)健康的首要原因,隨著我國(guó)進(jìn)入老齡社會(huì),心腦血管疾病的防治將面臨嚴(yán)峻形勢(shì)。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病、缺血性腦卒中等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ),AS發(fā)病過(guò)程漫長(zhǎng),其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。多種因素造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或功能異常被認(rèn)為是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié),由血流產(chǎn)生的剪切力在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中具有重要作用。人體血管一直暴露于搏動(dòng)性血流的作用下,主要受到兩種形式的機(jī)械力刺激,一種是由血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力(shear stress),一種是由心臟周期性搏動(dòng)產(chǎn)生的牽張力(stretch)。大量研究證實(shí),剪切力是影響內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的主要生物力。目前對(duì)剪切力調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制已有了許多認(rèn)識(shí)：內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞表面的具有感知機(jī)械信號(hào)刺激的各種受體、離子通路或特殊膜結(jié)構(gòu),將胞外機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào),通過(guò)各種細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的傳導(dǎo),激活細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)通路,促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的變化。在體內(nèi)的主動(dòng)脈根部、頸動(dòng)脈分叉、腎動(dòng)脈開(kāi)口等AS好發(fā)的部位,由于血流的紊亂,內(nèi)皮細(xì)胞主要受到低剪切力(low shear stress)和／或震蕩剪切力(oscillatory shear stress, OSS)的作用,研究證實(shí),這些部位的內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡水平；而在比較平直的血管部位,如腹主動(dòng)脈中段,內(nèi)皮細(xì)胞主要受到搏動(dòng)性的層流剪切力,即脈沖剪切力(pulsatile shear stress, PSS)的作用,具有較低的炎癥因子表達(dá)水平和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換水平。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotension system, RAS)過(guò)度激活與AS的發(fā)生密切相關(guān),血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ, AngⅡ)是RAS的主要效應(yīng)分子,具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥因子表達(dá)的作用,目前拮抗AngⅡ的作用已成為冠心病的基礎(chǔ)治療之一。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotension converting enzyme 2, ACE2)是RAS系統(tǒng)的一個(gè)重要成員,具有促進(jìn)AngⅡ降解生成血管緊張素1-7(angiontesion-(1-7))的作用。近年來(lái)的研究表明,ACE2主要通過(guò)Ang-(1-7)與其特異性受體MAS結(jié)合,發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激等內(nèi)皮保護(hù)作用。研究證實(shí),過(guò)表達(dá)ACE2能夠抑制血管AS的發(fā)生和進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),脈沖剪切力能夠影響血管內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotension converting enzyme, ACE)的表達(dá),調(diào)節(jié)Angll的水平,然而剪切力是否同樣可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)目前還未見(jiàn)報(bào)道。ACE2在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)豐富,基于近年來(lái)對(duì)ACE2在血管內(nèi)皮保護(hù)作用中的廣泛研究,以及脈沖剪切力在維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中的重要作用,我們推測(cè)ACE2可能參與脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控。明確脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮ACE2表達(dá)的影響,有利于進(jìn)一步理解RAS在AS發(fā)生過(guò)程中的作用具有重要意義。研究目的1.在體外細(xì)胞水平,明確脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮ACE2表達(dá)的影響。2.在體外細(xì)胞水平,明確ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中的作用。3.在整體動(dòng)物水平,觀察剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)嚴(yán)格無(wú)菌條件下獲得新生兒臍帶,采用胰酶消化法得到原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(]HUVECs),用含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基在37℃、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),傳代后改用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并利用細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定,實(shí)驗(yàn)選取4-8代內(nèi)皮細(xì)胞。2.剪切力干預(yù)將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上,在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí),利用Flexcell剪切力儀分別給予細(xì)胞脈沖剪切力(PSS, 12±4dyn/cm2, 1Hz)和震蕩剪切力(OSS,0±4 dyne/cm2, 1Hz)刺激不同的時(shí)間(0、1、3、6、12、18小時(shí)),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞,利用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)ACE2的mRNA及蛋白水平,明確不同形式的剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響的時(shí)間趨勢(shì)。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,使用TAKARA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR,目的基因擴(kuò)增引物由上海吉瑪生物公司合成。4.蛋白免疫印跡(Western blot, WB)細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞,利用酶裂解法收集胞漿蛋白,每個(gè)樣本均進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),加入適量loading buffer后煮沸5分鐘,然后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟,孵育一抗4℃過(guò)夜,次日孵育二抗,TBST洗膜后采用增強(qiáng)型ECL發(fā)光液顯影并觀察結(jié)果。5.細(xì)胞免疫熒光分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs以PSS、OSS刺激12小時(shí),連同靜止對(duì)照組細(xì)胞一起,經(jīng)過(guò)免疫染色固定,打孔、封閉,孵育一抗、二抗,染核,封片等步驟,然后在熒光顯微鏡下觀察不同組的細(xì)胞ACE2的表達(dá)差異6. AngⅡ與Ang-(1-7)水平檢測(cè)剪切力刺激細(xì)胞結(jié)束后,收集胞漿蛋白,測(cè)定各個(gè)樣本蛋白濃度,利用ELISA試劑盒分別檢測(cè)胞漿蛋白中AngⅡ與Ang-(1-7)的水平。7.NO水平測(cè)定剪切力干預(yù)細(xì)胞結(jié)束后,收集細(xì)胞,提取胞漿蛋白,采用碧云天NO定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO的含量。8.細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000,轉(zhuǎn)染不同濃度的ACE2 siRNA,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞,提取胞漿蛋白,利用WB檢測(cè)目的基因的蛋白水平,評(píng)價(jià)干擾效果,選擇合適的轉(zhuǎn)染濃度進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。9. BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖使用美國(guó)羅氏公司的BrdU試劑盒檢測(cè)ACE2在剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用,實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。接種HUVECs在載玻片上,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕o予相應(yīng)的預(yù)處理,然后再給予脈沖剪切力刺激,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)BrdU標(biāo)記、乙醇固定、anti-BrdU孵育、免疫熒光二抗孵育、DAPⅠ染核等步驟,在免疫熒光顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況,計(jì)算BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率。10. TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡利用美國(guó)Millipore公司的TUNEL試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況,具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。接種HUVECs細(xì)胞至載玻片上,經(jīng)過(guò)相應(yīng)的預(yù)處理后給予脈沖剪切力刺激,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫染色固定液固定、乙醇/乙酸混合液-20度孵育、TDT酶孵育等步驟,在熒光顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況,并計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率。11. En face組織免疫熒光選取10-12周的C57/BL6小鼠,深度麻醉后行甲醛灌注、固定,手術(shù)纖維鏡下分離主動(dòng)脈弓及胸腹主動(dòng)脈,仔細(xì)去除血管周?chē)窘Y(jié)締組織,縱向剖開(kāi)血管,封閉后共同孵育ACE2及CD31抗體,4℃過(guò)夜,次日用不同熒光標(biāo)記的二抗37℃調(diào)節(jié)下共同孵育,封片劑封片后在共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果。12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,兩組之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的比較采用單因素方差分析,使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,p0.05認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.脈沖剪切力(PSS)上調(diào)]HUVECsACE2的表達(dá)分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs不同時(shí)間(0、1、3、6、12、18小時(shí))的PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)和OSS (0±4 dyne/cm2,1Hz)刺激,qRT-PCR及WB分別檢測(cè)ACE2的mRNA及蛋白水平。結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照(0小時(shí))相比,PSS干預(yù)3小時(shí)后ACE2 mRNA的表達(dá)水平即明顯升高,一直持續(xù)到18小時(shí),這種上調(diào)作用仍顯著(p0.05); ACE2的蛋白表達(dá)水平自PSS刺激6小時(shí)后開(kāi)始明顯上調(diào),一直持續(xù)到18小時(shí),高峰在12小時(shí)(p0.05)。而與靜止對(duì)照相比,OSS自3小時(shí)開(kāi)始上調(diào)ACE2 mRNA的表達(dá),直到12小時(shí),而OSS干預(yù)18小時(shí)后,ACE2 mRNA水平恢復(fù)靜止對(duì)照組的水平；WB結(jié)果顯示,在OSS刺激6小時(shí)后,ACE2蛋白水平開(kāi)始升高,一直持續(xù)至12小時(shí),而18小時(shí)后ACE2蛋白水平即降至靜止對(duì)照水平。為進(jìn)一步明確PSS和OSS對(duì)ACE2表達(dá)的影響,分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs以O(shè)SS和PSS刺激12小時(shí),利用qRT-PCR, WB以及細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照比較,PSS和OSS刺激12小時(shí)后,ACE2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(p0.05)；而與PSS比較,OSS則明顯減少內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)(p0.05)。此外,與靜止對(duì)照組及OSS組比較,PSS刺激HUVECs12小時(shí)后,細(xì)胞排列方向具有顯著的一致性,沿培養(yǎng)基流動(dòng)的長(zhǎng)軸排列,而靜止培養(yǎng)組與OSS刺激組,細(xì)胞排列方式則較為雜亂無(wú)序。2.PSS通過(guò)上調(diào)ACE2調(diào)節(jié)HUVECs中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平給予體外培養(yǎng)的HUVECs PSS干預(yù)12小時(shí),ELISA法測(cè)定細(xì)胞漿中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平。結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照組比較,PSS顯著上調(diào)細(xì)胞中Ang-(1-7)的水平(p0.05),而抑制AngⅡ的水平(p0.05)；分別轉(zhuǎn)染ACE2siRNA和陰性對(duì)照(NC)siRNA后,再給予PSS干預(yù)12小時(shí),結(jié)果顯示ACE2siRNA明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高,并促進(jìn)AngⅡ的水平(p0.05)；在PSS刺激前,預(yù)孵育ACE2抑制劑DX600,結(jié)果顯示：與預(yù)孵育DMSO比較,DX600明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高,并促進(jìn)AngⅡ的水平(p0.05)。3.ACE2參與介導(dǎo)PSS促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生為明確ACE2是否參與PSS調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成,體外培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或預(yù)孵育Ang-(1-7)抑制劑MLN-4760處理,再給予PSS刺激12小時(shí),檢測(cè)細(xì)胞漿中NO水平,結(jié)果顯示：PSS明顯增加胞漿中NO的含量,而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或MLN-4760預(yù)處理能夠顯著抑制PSS誘導(dǎo)的NO生成；另外,WB結(jié)果顯示,與靜止對(duì)照比較,PSS組細(xì)胞eNOS和p-eNOS (Ser1177)的表達(dá)水平明顯升高(p0.05),而轉(zhuǎn)染特異性siRNA抑制ACE2的表達(dá)后,再給予細(xì)胞PSS刺激12小時(shí),PSS誘導(dǎo)的eNOS、 p-eNOS的表達(dá)水平也受到明顯抑制(p0.05)；4.ACE2參與PSS抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子的表達(dá)預(yù)先給予體外培養(yǎng)的HUVECs TNF-a (100nM)刺激12小時(shí)以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),然后給予12小時(shí)的PSS刺激或繼續(xù)靜止培養(yǎng)12小時(shí)。結(jié)果顯示,與靜止對(duì)照組比較,PSS明顯抑制粘附因子VCAM-1、MCP-1的蛋白表達(dá)水平(p0.05)；而在轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA的細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染NC siRNA組細(xì)胞相比,VCAM-1、MCP-1的表達(dá)顯著升高(p0.05)。5.ACE2在PSS抑制HUVECs增殖中發(fā)揮作用與靜止對(duì)照組比較,PSS刺激組細(xì)胞的BrdU陽(yáng)性率明顯降低(p0.05),而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA組細(xì)胞的BrdU陽(yáng)性率較轉(zhuǎn)染NC siRNA組細(xì)胞明顯升高(p0.05)；WB結(jié)果顯示,PSS明顯上調(diào)HUVECs p21的蛋白水平,而通過(guò)siRNA抑制ACE2表達(dá)后,PSS上調(diào)的p21蛋白水平得到顯著抑制(p0.05)。6.ACE2不參與PSS抑制]HUVECs的凋亡TUNEL結(jié)果顯示,PSS組細(xì)胞較靜止對(duì)照組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率明顯降低(p0.05),而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA后,細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率較NC siRNA組無(wú)明顯差異(p0.05)；利用WB檢測(cè)各組細(xì)胞cleaved-caspase3的表達(dá)情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA對(duì)PSS抑制的cleaved-caspase3的表達(dá)無(wú)明顯影響(p0.05)。7.ACE2在小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于主動(dòng)脈弓小彎側(cè)由于小鼠主動(dòng)脈弓小彎側(cè)的血流紊亂,該處內(nèi)皮細(xì)胞主要受到OSS的作用,而腹主動(dòng)脈段的血流方向具有較好的一致性,該處內(nèi)皮細(xì)胞主要受到PSS的作用,利用En face組織免疫熒光染色分別檢測(cè)上述部位內(nèi)皮中ACE2的表達(dá),結(jié)果顯示ACE2在小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于主動(dòng)脈弓小彎側(cè)(p0.05)。結(jié)論(1)脈沖剪切力顯著上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。(2)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成和抑制細(xì)胞增殖。(3)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力的抗炎作用,但不參與脈沖剪切力調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。脈沖剪切力上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的分子機(jī)制研究研究背景血管內(nèi)皮細(xì)胞一直暴露于剪切力的作用下,由方向穩(wěn)定的血流產(chǎn)生的脈沖剪切力具有顯著的維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài),抗動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用；而血管分叉處的內(nèi)皮細(xì)胞,由于受到紊亂血流產(chǎn)生的震蕩剪切力或低剪切力的作用,具有較高的氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng),傾向于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。盡管剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關(guān),但其中具體的分子機(jī)制還不完全明確,近年來(lái)的研究亦發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的基因表達(dá)受到剪切力的調(diào)節(jié),并參與血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。ACE2具有顯著的內(nèi)皮保護(hù)及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,在我們的前期研究中也發(fā)現(xiàn),脈沖剪切力明顯上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)水平,然而,目前我們對(duì)ACE2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制還知之甚少。深入研究ACE2表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制有利于更好的了解RAS在剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能中的作用。剪切力可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯后等水平調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),剪切力可以通過(guò)抑制ACE啟動(dòng)子的活性在轉(zhuǎn)錄水平抑制其表達(dá),還可以通過(guò)上調(diào)miR-143/145的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)；此外,剪切力對(duì)內(nèi)皮NO產(chǎn)生的調(diào)節(jié)也在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面發(fā)揮作用。作為RAS中重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化基因,ACE2的表達(dá)是否也在上述多個(gè)水平受到調(diào)控還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。AMPK(AMP-activated protein kinase)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,AMPK通路是剪切力發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用的關(guān)鍵信號(hào)通路,廣泛參與了抗炎、抗氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期等多種內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)。有研究表明,脈沖剪切力可以通過(guò)激活A(yù)MPK通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成和降低ROS的水平；新近的一項(xiàng)研究則證實(shí),剪切力可以通過(guò)激活的AMPK通路上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞miR-143/145的水平,后者在轉(zhuǎn)錄后水平抑制ACE的表達(dá),從而拮抗AngⅡ致病的生物學(xué)作用；另外,有研究發(fā)現(xiàn),在低氧等細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下,AMPK的激動(dòng)劑AICAR能夠通過(guò)上調(diào)Sirtl的表達(dá),促進(jìn)ACE2的轉(zhuǎn)錄。由此可見(jiàn),AMPK信號(hào)通路與RAS各組分之間的表達(dá)水平密切相關(guān),作為脈沖剪切力激活的重要內(nèi)皮保護(hù)性通路,AMPK通路是否參與調(diào)節(jié)PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)?這一問(wèn)題還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。轉(zhuǎn)錄因子KLF2(Kru"ppel-Like Factor 2)是介導(dǎo)脈沖剪切力維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài),抗AS作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究證實(shí),PSS可通過(guò)激活A(yù)MPK-ERK5/MEF2通路上調(diào)KLF2的表達(dá),后者大約參與調(diào)節(jié)50-70%PSS敏感基因的表達(dá),具有顯著的抗炎、抗氧化作用。在各種病理生理?xiàng)l件下,目前還未見(jiàn)KLF2與ACE2關(guān)系的報(bào)道,但是鑒于兩者廣泛的內(nèi)皮保護(hù)作用,我們推測(cè)KLF2可能是PSS誘導(dǎo)ACE2表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。在剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中,AMPK通路是KLF2的重要上游信號(hào)通路,因此,我們推測(cè)脈沖剪切力有可能通過(guò)AMPK-KLF2通路上調(diào)ACE2的表達(dá)。研究目的(1)明確脈沖剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2 mRNA穩(wěn)定性及啟動(dòng)子活性的影響。(2)明確脈沖剪切力是否通過(guò)AMPK-KLF2通路上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。研究方法1.內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及剪切力干預(yù)復(fù)蘇前期實(shí)驗(yàn)凍存的HUVECs,4-7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上,在完全培養(yǎng)基(M199、10%FBS、100U/ml Penicillin-Streptomycin、2ng/ml成纖維生長(zhǎng)因子)中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%時(shí),利用Flexcell剪切力儀給予細(xì)胞脈沖剪切力(PSS,1Hz,12±4dyn/cm2)刺激。2.ACE2 mRNA穩(wěn)定性檢測(cè)利用放線菌酮cycloheximide (CHX, 0.1mg/ml)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞30min,以阻斷新的ACE2轉(zhuǎn)錄,然后再分別給予PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)干預(yù)或靜止培養(yǎng)0、1、3、6、12小時(shí),收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA,利用real time PCR檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ACE2的mRNA水平,明確PSS是否影響ACE2 mRNA的穩(wěn)定性。3.ACE2啟動(dòng)子活性檢測(cè)利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的人ACE2啟動(dòng)子表達(dá)載體(pGL3-ACE2-promoter),與PRL-TK載體一起共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h小時(shí)后,再分別給予PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)刺激或靜態(tài)培養(yǎng)3小時(shí),收集細(xì)胞利用Promega雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ACE2啟動(dòng)子活性的變化。4. Western blot (WB)細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞,利用酶裂解法收集蛋白,每個(gè)樣本均進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),加入適量5 X loading buffer后煮沸5分鐘使蛋白變性,然后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟,孵育一抗4℃過(guò)夜,次日孵育二抗1小時(shí),然后經(jīng)過(guò)TBST洗膜后采用Millipore發(fā)光液顯影并觀察結(jié)果。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,使用TAKARA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR,目的基因擴(kuò)增引物由上海吉瑪生物公司合成。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,兩組之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的比較采用單因素方差分析,使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,p0.05認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.PSS不影響內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的mRNA穩(wěn)定性利用放線菌酮阻斷新的ACE2合成后,再給予PSS分別刺激內(nèi)皮細(xì)胞1、3、6、12小時(shí),收集細(xì)胞蛋白后利用WB檢測(cè)ACE2的蛋白水平,結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照組中的對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比較,ACE2 mRNA的降解速率沒(méi)有顯著變化(p0.05)。2.PSS顯著增強(qiáng)ACE2啟動(dòng)子的活性實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的人ACE2啟動(dòng)子載體(pGL3-ACE2-promoter)長(zhǎng)度為1908 bp；利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pGL3-ACE2-promoter與空載體pGL3-basic vector,24小時(shí)后給予細(xì)胞PSS刺激3小時(shí),收集細(xì)胞,利用Promega雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定剪切力干預(yù)組及靜態(tài)對(duì)照組細(xì)胞ACE2啟動(dòng)子的活性變化。結(jié)果顯示,對(duì)靜止對(duì)照組比較,PSS顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2啟動(dòng)子的活性(p0.05)。3.KLF2參與PSS調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)給予體外培養(yǎng)的HUVECs脈沖剪切力分別刺激0.5、1、3、6小時(shí),WB結(jié)果顯示KLF2的蛋白表達(dá)水平自1小時(shí)開(kāi)始明顯上升,持續(xù)至6小時(shí)(p0.05)；轉(zhuǎn)染KLF2 siRNA抑制PSS誘導(dǎo)的KLF2表達(dá),與陰性對(duì)照siRNA比較,PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)明顯下調(diào)(p0.05)。4.Akt通路不參與PSS調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)給予HUVECs PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)分別刺激0、0.5、1、2、3、6 hr,收集細(xì)胞提取胞漿蛋白,Western blot檢測(cè)total-Akt及p- Akt的水平,結(jié)果顯示p- Akt水平自0.5小時(shí)即達(dá)到高峰,3小時(shí)回復(fù)到靜止對(duì)照水平；預(yù)先用Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞30分鐘以阻斷Akt通路的激活,再給予PSS刺激,WB結(jié)果顯示,LY294002不影響PSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)(p0.05)。5. AMPK-KLF2信號(hào)通路參與介導(dǎo)PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)給予HUVECs PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)分別刺激0、0.5、1、3、6小時(shí),收集細(xì)胞提取胞漿蛋白,Western blot檢測(cè)AMPKα2及p- AMPKα2的水平,結(jié)果顯示p- AMPKα2的水平自0.5hr開(kāi)始升高,lhr達(dá)到高峰(p0.05)；利用AMPK抑制劑Compound C(100uM)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí),然后再給予PSS刺激1、3、6小時(shí),結(jié)果顯示：與DMSO組相比較,PSS誘導(dǎo)的KLF2蛋白表達(dá)受到明顯抑制,而ACE2的mRNA及蛋白水平亦明顯下調(diào)(p0.05),這提示AMPK-KLF2通路參與PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)上調(diào)。結(jié)論(1)脈沖剪切力在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。(2)脈沖剪切力通過(guò)AMPK-KLF2途徑上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。(3)Akt通路不參與PSS調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R743;R54

【參考文獻(xiàn)】

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1 Kazim Husain;Wilfredo Hernandez;Rais A Ansari;Leon Ferder;;Inflammation, oxidative stress and renin angiotensin system in atherosclerosis[J];World Journal of Biological Chemistry;2015年03期

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本文編號(hào)：1553583