本文關(guān)鍵詞： ACE2 剪切力 內(nèi)皮細(xì)胞 動(dòng)脈粥樣硬化 剪切力 內(nèi)皮細(xì)胞 ACE2 KLF2 AMPK　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用研究背景心腦血管疾病已成為危害人類健康的首要原因,隨著我國(guó)進(jìn)入老齡社會(huì),心腦血管疾病的防治將面臨嚴(yán)峻形勢(shì)。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病、缺血性腦卒中等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ),AS發(fā)病過程漫長(zhǎng),其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。多種因素造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或功能異常被認(rèn)為是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié),由血流產(chǎn)生的剪切力在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中具有重要作用。人體血管一直暴露于搏動(dòng)性血流的作用下,主要受到兩種形式的機(jī)械力刺激,一種是由血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力(shear stress),一種是由心臟周期性搏動(dòng)產(chǎn)生的牽張力(stretch)。大量研究證實(shí),剪切力是影響內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的主要生物力。目前對(duì)剪切力調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制已有了許多認(rèn)識(shí)：內(nèi)皮細(xì)胞通過細(xì)胞表面的具有感知機(jī)械信號(hào)刺激的各種受體、離子通路或特殊膜結(jié)構(gòu),將胞外機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào),通過各種細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的傳導(dǎo),激活細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)通路,促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的變化。在體內(nèi)的主動(dòng)脈根部、頸動(dòng)脈分叉、腎動(dòng)脈開口等AS好發(fā)的部位,由于血流的紊亂,內(nèi)皮細(xì)胞主要受到低剪切力(low shear stress)和／或震蕩剪切力(oscillatory shear stress, OSS)的作用,研究證實(shí),這些部位的內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡水平；而在比較平直的血管部位,如腹主動(dòng)脈中段,內(nèi)皮細(xì)胞主要受到搏動(dòng)性的層流剪切力,即脈沖剪切力(pulsatile shear stress, PSS)的作用,具有較低的炎癥因子表達(dá)水平和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換水平。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotension system, RAS)過度激活與AS的發(fā)生密切相關(guān),血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ, AngⅡ)是RAS的主要效應(yīng)分子,具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥因子表達(dá)的作用,目前拮抗AngⅡ的作用已成為冠心病的基礎(chǔ)治療之一。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotension converting enzyme 2, ACE2)是RAS系統(tǒng)的一個(gè)重要成員,具有促進(jìn)AngⅡ降解生成血管緊張素1-7(angiontesion-(1-7))的作用。近年來的研究表明,ACE2主要通過Ang-(1-7)與其特異性受體MAS結(jié)合,發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激等內(nèi)皮保護(hù)作用。研究證實(shí),過表達(dá)ACE2能夠抑制血管AS的發(fā)生和進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),脈沖剪切力能夠影響血管內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotension converting enzyme, ACE)的表達(dá),調(diào)節(jié)Angll的水平,然而剪切力是否同樣可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)目前還未見報(bào)道。ACE2在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)豐富,基于近年來對(duì)ACE2在血管內(nèi)皮保護(hù)作用中的廣泛研究,以及脈沖剪切力在維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中的重要作用,我們推測(cè)ACE2可能參與脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控。明確脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮ACE2表達(dá)的影響,有利于進(jìn)一步理解RAS在AS發(fā)生過程中的作用具有重要意義。研究目的1.在體外細(xì)胞水平,明確脈沖剪切力對(duì)血管內(nèi)皮ACE2表達(dá)的影響。2.在體外細(xì)胞水平,明確ACE2在脈沖剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中的作用。3.在整體動(dòng)物水平,觀察剪切力對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)嚴(yán)格無菌條件下獲得新生兒臍帶,采用胰酶消化法得到原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(]HUVECs),用含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基在37℃、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),傳代后改用含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),并利用細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定,實(shí)驗(yàn)選取4-8代內(nèi)皮細(xì)胞。2.剪切力干預(yù)將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上,在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí),利用Flexcell剪切力儀分別給予細(xì)胞脈沖剪切力(PSS, 12±4dyn/cm2, 1Hz)和震蕩剪切力(OSS,0±4 dyne/cm2, 1Hz)刺激不同的時(shí)間(0、1、3、6、12、18小時(shí)),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞,利用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)ACE2的mRNA及蛋白水平,明確不同形式的剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的影響的時(shí)間趨勢(shì)。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,使用TAKARA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR,目的基因擴(kuò)增引物由上海吉瑪生物公司合成。4.蛋白免疫印跡(Western blot, WB)細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞,利用酶裂解法收集胞漿蛋白,每個(gè)樣本均進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),加入適量loading buffer后煮沸5分鐘,然后經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟,孵育一抗4℃過夜,次日孵育二抗,TBST洗膜后采用增強(qiáng)型ECL發(fā)光液顯影并觀察結(jié)果。5.細(xì)胞免疫熒光分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs以PSS、OSS刺激12小時(shí),連同靜止對(duì)照組細(xì)胞一起,經(jīng)過免疫染色固定,打孔、封閉,孵育一抗、二抗,染核,封片等步驟,然后在熒光顯微鏡下觀察不同組的細(xì)胞ACE2的表達(dá)差異6. AngⅡ與Ang-(1-7)水平檢測(cè)剪切力刺激細(xì)胞結(jié)束后,收集胞漿蛋白,測(cè)定各個(gè)樣本蛋白濃度,利用ELISA試劑盒分別檢測(cè)胞漿蛋白中AngⅡ與Ang-(1-7)的水平。7.NO水平測(cè)定剪切力干預(yù)細(xì)胞結(jié)束后,收集細(xì)胞,提取胞漿蛋白,采用碧云天NO定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO的含量。8.細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用陽離子脂質(zhì)體2000,轉(zhuǎn)染不同濃度的ACE2 siRNA,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞,提取胞漿蛋白,利用WB檢測(cè)目的基因的蛋白水平,評(píng)價(jià)干擾效果,選擇合適的轉(zhuǎn)染濃度進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。9. BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖使用美國(guó)羅氏公司的BrdU試劑盒檢測(cè)ACE2在剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用,實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。接種HUVECs在載玻片上,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕o予相應(yīng)的預(yù)處理,然后再給予脈沖剪切力刺激,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組細(xì)胞經(jīng)過BrdU標(biāo)記、乙醇固定、anti-BrdU孵育、免疫熒光二抗孵育、DAPⅠ染核等步驟,在免疫熒光顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況,計(jì)算BrdU陽性細(xì)胞率。10. TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡利用美國(guó)Millipore公司的TUNEL試劑盒檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況,具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。接種HUVECs細(xì)胞至載玻片上,經(jīng)過相應(yīng)的預(yù)處理后給予脈沖剪切力刺激,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組細(xì)胞經(jīng)過免疫染色固定液固定、乙醇/乙酸混合液-20度孵育、TDT酶孵育等步驟,在熒光顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況,并計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞率。11. En face組織免疫熒光選取10-12周的C57/BL6小鼠,深度麻醉后行甲醛灌注、固定,手術(shù)纖維鏡下分離主動(dòng)脈弓及胸腹主動(dòng)脈,仔細(xì)去除血管周圍脂肪結(jié)締組織,縱向剖開血管,封閉后共同孵育ACE2及CD31抗體,4℃過夜,次日用不同熒光標(biāo)記的二抗37℃調(diào)節(jié)下共同孵育,封片劑封片后在共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果。12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,兩組之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的比較采用單因素方差分析,使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,p0.05認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.脈沖剪切力(PSS)上調(diào)]HUVECsACE2的表達(dá)分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs不同時(shí)間(0、1、3、6、12、18小時(shí))的PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)和OSS (0±4 dyne/cm2,1Hz)刺激,qRT-PCR及WB分別檢測(cè)ACE2的mRNA及蛋白水平。結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照(0小時(shí))相比,PSS干預(yù)3小時(shí)后ACE2 mRNA的表達(dá)水平即明顯升高,一直持續(xù)到18小時(shí),這種上調(diào)作用仍顯著(p0.05); ACE2的蛋白表達(dá)水平自PSS刺激6小時(shí)后開始明顯上調(diào),一直持續(xù)到18小時(shí),高峰在12小時(shí)(p0.05)。而與靜止對(duì)照相比,OSS自3小時(shí)開始上調(diào)ACE2 mRNA的表達(dá),直到12小時(shí),而OSS干預(yù)18小時(shí)后,ACE2 mRNA水平恢復(fù)靜止對(duì)照組的水平；WB結(jié)果顯示,在OSS刺激6小時(shí)后,ACE2蛋白水平開始升高,一直持續(xù)至12小時(shí),而18小時(shí)后ACE2蛋白水平即降至靜止對(duì)照水平。為進(jìn)一步明確PSS和OSS對(duì)ACE2表達(dá)的影響,分別給予體外培養(yǎng)的HUVECs以O(shè)SS和PSS刺激12小時(shí),利用qRT-PCR, WB以及細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照比較,PSS和OSS刺激12小時(shí)后,ACE2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯升高(p0.05)；而與PSS比較,OSS則明顯減少內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)(p0.05)。此外,與靜止對(duì)照組及OSS組比較,PSS刺激HUVECs12小時(shí)后,細(xì)胞排列方向具有顯著的一致性,沿培養(yǎng)基流動(dòng)的長(zhǎng)軸排列,而靜止培養(yǎng)組與OSS刺激組,細(xì)胞排列方式則較為雜亂無序。2.PSS通過上調(diào)ACE2調(diào)節(jié)HUVECs中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平給予體外培養(yǎng)的HUVECs PSS干預(yù)12小時(shí),ELISA法測(cè)定細(xì)胞漿中Ang-(1-7)及AngⅡ的水平。結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照組比較,PSS顯著上調(diào)細(xì)胞中Ang-(1-7)的水平(p0.05),而抑制AngⅡ的水平(p0.05)；分別轉(zhuǎn)染ACE2siRNA和陰性對(duì)照(NC)siRNA后,再給予PSS干預(yù)12小時(shí),結(jié)果顯示ACE2siRNA明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高,并促進(jìn)AngⅡ的水平(p0.05)；在PSS刺激前,預(yù)孵育ACE2抑制劑DX600,結(jié)果顯示：與預(yù)孵育DMSO比較,DX600明顯抑制PSS誘導(dǎo)的Ang-(1-7)水平增高,并促進(jìn)AngⅡ的水平(p0.05)。3.ACE2參與介導(dǎo)PSS促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生為明確ACE2是否參與PSS調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成,體外培養(yǎng)的HUVECs經(jīng)過轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或預(yù)孵育Ang-(1-7)抑制劑MLN-4760處理,再給予PSS刺激12小時(shí),檢測(cè)細(xì)胞漿中NO水平,結(jié)果顯示：PSS明顯增加胞漿中NO的含量,而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA或MLN-4760預(yù)處理能夠顯著抑制PSS誘導(dǎo)的NO生成；另外,WB結(jié)果顯示,與靜止對(duì)照比較,PSS組細(xì)胞eNOS和p-eNOS (Ser1177)的表達(dá)水平明顯升高(p0.05),而轉(zhuǎn)染特異性siRNA抑制ACE2的表達(dá)后,再給予細(xì)胞PSS刺激12小時(shí),PSS誘導(dǎo)的eNOS、 p-eNOS的表達(dá)水平也受到明顯抑制(p0.05)；4.ACE2參與PSS抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子的表達(dá)預(yù)先給予體外培養(yǎng)的HUVECs TNF-a (100nM)刺激12小時(shí)以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),然后給予12小時(shí)的PSS刺激或繼續(xù)靜止培養(yǎng)12小時(shí)。結(jié)果顯示,與靜止對(duì)照組比較,PSS明顯抑制粘附因子VCAM-1、MCP-1的蛋白表達(dá)水平(p0.05)；而在轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA的細(xì)胞中,與轉(zhuǎn)染NC siRNA組細(xì)胞相比,VCAM-1、MCP-1的表達(dá)顯著升高(p0.05)。5.ACE2在PSS抑制HUVECs增殖中發(fā)揮作用與靜止對(duì)照組比較,PSS刺激組細(xì)胞的BrdU陽性率明顯降低(p0.05),而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA組細(xì)胞的BrdU陽性率較轉(zhuǎn)染NC siRNA組細(xì)胞明顯升高(p0.05)；WB結(jié)果顯示,PSS明顯上調(diào)HUVECs p21的蛋白水平,而通過siRNA抑制ACE2表達(dá)后,PSS上調(diào)的p21蛋白水平得到顯著抑制(p0.05)。6.ACE2不參與PSS抑制]HUVECs的凋亡TUNEL結(jié)果顯示,PSS組細(xì)胞較靜止對(duì)照組細(xì)胞凋亡陽性率明顯降低(p0.05),而轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA后,細(xì)胞凋亡陽性率較NC siRNA組無明顯差異(p0.05)；利用WB檢測(cè)各組細(xì)胞cleaved-caspase3的表達(dá)情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染ACE2 siRNA對(duì)PSS抑制的cleaved-caspase3的表達(dá)無明顯影響(p0.05)。7.ACE2在小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于主動(dòng)脈弓小彎側(cè)由于小鼠主動(dòng)脈弓小彎側(cè)的血流紊亂,該處內(nèi)皮細(xì)胞主要受到OSS的作用,而腹主動(dòng)脈段的血流方向具有較好的一致性,該處內(nèi)皮細(xì)胞主要受到PSS的作用,利用En face組織免疫熒光染色分別檢測(cè)上述部位內(nèi)皮中ACE2的表達(dá),結(jié)果顯示ACE2在小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于主動(dòng)脈弓小彎側(cè)(p0.05)。結(jié)論(1)脈沖剪切力顯著上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。(2)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成和抑制細(xì)胞增殖。(3)ACE2參與調(diào)節(jié)脈沖剪切力的抗炎作用,但不參與脈沖剪切力調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。脈沖剪切力上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)的分子機(jī)制研究研究背景血管內(nèi)皮細(xì)胞一直暴露于剪切力的作用下,由方向穩(wěn)定的血流產(chǎn)生的脈沖剪切力具有顯著的維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài),抗動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用；而血管分叉處的內(nèi)皮細(xì)胞,由于受到紊亂血流產(chǎn)生的震蕩剪切力或低剪切力的作用,具有較高的氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng),傾向于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。盡管剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關(guān),但其中具體的分子機(jī)制還不完全明確,近年來的研究亦發(fā)現(xiàn)越來越多的基因表達(dá)受到剪切力的調(diào)節(jié),并參與血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。ACE2具有顯著的內(nèi)皮保護(hù)及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,在我們的前期研究中也發(fā)現(xiàn),脈沖剪切力明顯上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)水平,然而,目前我們對(duì)ACE2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制還知之甚少。深入研究ACE2表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制有利于更好的了解RAS在剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能中的作用。剪切力可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯后等水平調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),剪切力可以通過抑制ACE啟動(dòng)子的活性在轉(zhuǎn)錄水平抑制其表達(dá),還可以通過上調(diào)miR-143/145的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其表達(dá)；此外,剪切力對(duì)內(nèi)皮NO產(chǎn)生的調(diào)節(jié)也在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面發(fā)揮作用。作為RAS中重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化基因,ACE2的表達(dá)是否也在上述多個(gè)水平受到調(diào)控還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。AMPK(AMP-activated protein kinase)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,AMPK通路是剪切力發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用的關(guān)鍵信號(hào)通路,廣泛參與了抗炎、抗氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期等多種內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)節(jié)。有研究表明,脈沖剪切力可以通過激活A(yù)MPK通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成和降低ROS的水平；新近的一項(xiàng)研究則證實(shí),剪切力可以通過激活的AMPK通路上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞miR-143/145的水平,后者在轉(zhuǎn)錄后水平抑制ACE的表達(dá),從而拮抗AngⅡ致病的生物學(xué)作用；另外,有研究發(fā)現(xiàn),在低氧等細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下,AMPK的激動(dòng)劑AICAR能夠通過上調(diào)Sirtl的表達(dá),促進(jìn)ACE2的轉(zhuǎn)錄。由此可見,AMPK信號(hào)通路與RAS各組分之間的表達(dá)水平密切相關(guān),作為脈沖剪切力激活的重要內(nèi)皮保護(hù)性通路,AMPK通路是否參與調(diào)節(jié)PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)?這一問題還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。轉(zhuǎn)錄因子KLF2(Kru"ppel-Like Factor 2)是介導(dǎo)脈沖剪切力維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài),抗AS作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究證實(shí),PSS可通過激活A(yù)MPK-ERK5/MEF2通路上調(diào)KLF2的表達(dá),后者大約參與調(diào)節(jié)50-70%PSS敏感基因的表達(dá),具有顯著的抗炎、抗氧化作用。在各種病理生理?xiàng)l件下,目前還未見KLF2與ACE2關(guān)系的報(bào)道,但是鑒于兩者廣泛的內(nèi)皮保護(hù)作用,我們推測(cè)KLF2可能是PSS誘導(dǎo)ACE2表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。在剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中,AMPK通路是KLF2的重要上游信號(hào)通路,因此,我們推測(cè)脈沖剪切力有可能通過AMPK-KLF2通路上調(diào)ACE2的表達(dá)。研究目的(1)明確脈沖剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2 mRNA穩(wěn)定性及啟動(dòng)子活性的影響。(2)明確脈沖剪切力是否通過AMPK-KLF2通路上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。研究方法1.內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及剪切力干預(yù)復(fù)蘇前期實(shí)驗(yàn)凍存的HUVECs,4-7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HUVECs接種至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的載玻片上,在完全培養(yǎng)基(M199、10%FBS、100U/ml Penicillin-Streptomycin、2ng/ml成纖維生長(zhǎng)因子)中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%時(shí),利用Flexcell剪切力儀給予細(xì)胞脈沖剪切力(PSS,1Hz,12±4dyn/cm2)刺激。2.ACE2 mRNA穩(wěn)定性檢測(cè)利用放線菌酮cycloheximide (CHX, 0.1mg/ml)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞30min,以阻斷新的ACE2轉(zhuǎn)錄,然后再分別給予PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)干預(yù)或靜止培養(yǎng)0、1、3、6、12小時(shí),收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA,利用real time PCR檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ACE2的mRNA水平,明確PSS是否影響ACE2 mRNA的穩(wěn)定性。3.ACE2啟動(dòng)子活性檢測(cè)利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的人ACE2啟動(dòng)子表達(dá)載體(pGL3-ACE2-promoter),與PRL-TK載體一起共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h小時(shí)后,再分別給予PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)刺激或靜態(tài)培養(yǎng)3小時(shí),收集細(xì)胞利用Promega雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ACE2啟動(dòng)子活性的變化。4. Western blot (WB)細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞,利用酶裂解法收集蛋白,每個(gè)樣本均進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),加入適量5 X loading buffer后煮沸5分鐘使蛋白變性,然后經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟,孵育一抗4℃過夜,次日孵育二抗1小時(shí),然后經(jīng)過TBST洗膜后采用Millipore發(fā)光液顯影并觀察結(jié)果。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,使用TAKARA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR,目的基因擴(kuò)增引物由上海吉瑪生物公司合成。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,兩組之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn),多組之間的比較采用單因素方差分析,使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,p0.05認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果1.PSS不影響內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的mRNA穩(wěn)定性利用放線菌酮阻斷新的ACE2合成后,再給予PSS分別刺激內(nèi)皮細(xì)胞1、3、6、12小時(shí),收集細(xì)胞蛋白后利用WB檢測(cè)ACE2的蛋白水平,結(jié)果顯示：與靜止對(duì)照組中的對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比較,ACE2 mRNA的降解速率沒有顯著變化(p0.05)。2.PSS顯著增強(qiáng)ACE2啟動(dòng)子的活性實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的人ACE2啟動(dòng)子載體(pGL3-ACE2-promoter)長(zhǎng)度為1908 bp；利用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染pGL3-ACE2-promoter與空載體pGL3-basic vector,24小時(shí)后給予細(xì)胞PSS刺激3小時(shí),收集細(xì)胞,利用Promega雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定剪切力干預(yù)組及靜態(tài)對(duì)照組細(xì)胞ACE2啟動(dòng)子的活性變化。結(jié)果顯示,對(duì)靜止對(duì)照組比較,PSS顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2啟動(dòng)子的活性(p0.05)。3.KLF2參與PSS調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)給予體外培養(yǎng)的HUVECs脈沖剪切力分別刺激0.5、1、3、6小時(shí),WB結(jié)果顯示KLF2的蛋白表達(dá)水平自1小時(shí)開始明顯上升,持續(xù)至6小時(shí)(p0.05)；轉(zhuǎn)染KLF2 siRNA抑制PSS誘導(dǎo)的KLF2表達(dá),與陰性對(duì)照siRNA比較,PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)明顯下調(diào)(p0.05)。4.Akt通路不參與PSS調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)給予HUVECs PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)分別刺激0、0.5、1、2、3、6 hr,收集細(xì)胞提取胞漿蛋白,Western blot檢測(cè)total-Akt及p- Akt的水平,結(jié)果顯示p- Akt水平自0.5小時(shí)即達(dá)到高峰,3小時(shí)回復(fù)到靜止對(duì)照水平；預(yù)先用Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞30分鐘以阻斷Akt通路的激活,再給予PSS刺激,WB結(jié)果顯示,LY294002不影響PSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ACE2表達(dá)(p0.05)。5. AMPK-KLF2信號(hào)通路參與介導(dǎo)PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)給予HUVECs PSS(12±4dyn/cm2, 1Hz)分別刺激0、0.5、1、3、6小時(shí),收集細(xì)胞提取胞漿蛋白,Western blot檢測(cè)AMPKα2及p- AMPKα2的水平,結(jié)果顯示p- AMPKα2的水平自0.5hr開始升高,lhr達(dá)到高峰(p0.05)；利用AMPK抑制劑Compound C(100uM)預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí),然后再給予PSS刺激1、3、6小時(shí),結(jié)果顯示：與DMSO組相比較,PSS誘導(dǎo)的KLF2蛋白表達(dá)受到明顯抑制,而ACE2的mRNA及蛋白水平亦明顯下調(diào)(p0.05),這提示AMPK-KLF2通路參與PSS誘導(dǎo)的ACE2表達(dá)上調(diào)。結(jié)論(1)脈沖剪切力在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。(2)脈沖剪切力通過AMPK-KLF2途徑上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ACE2的表達(dá)。(3)Akt通路不參與PSS調(diào)節(jié)ACE2的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743;R54

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Kazim Husain;Wilfredo Hernandez;Rais A Ansari;Leon Ferder;;Inflammation, oxidative stress and renin angiotensin system in atherosclerosis[J];World Journal of Biological Chemistry;2015年03期

，

本文編號(hào)：1553583