本文關(guān)鍵詞： 順鉑 miRNA 神經(jīng)母細胞瘤 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 細胞增殖 基因表達　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：神經(jīng)母細胞瘤是兒童時期最常見的惡性腫瘤,平均發(fā)病年齡為17個月。腫瘤起源于神經(jīng)嵴組織,發(fā)生在人體深部腎上腺髓質(zhì)和椎旁神經(jīng)節(jié)位置。由于沒有特定的臨床表現(xiàn),大約50%到60%的患者被確診時已到晚期。經(jīng)過多學(xué)科治療,甚至引入劑量密集化療方案,但高風(fēng)險神經(jīng)母細胞瘤的預(yù)后仍然無明顯改善,5年生存率小于50%。 MicroRNAs(miRNAs)是非編碼小RNA,參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。通過與靶mRNA不完全結(jié)合,導(dǎo)致翻譯抑制或靶基因的不穩(wěn)定。miRNA可作為腫瘤抑制基因和癌基因。研究表明,miR-106a在胃癌組織中過表達,具有致瘤作用。miR-16作為腫瘤抑制基因,通過調(diào)節(jié)BMIl,在套細胞淋巴瘤SP細胞中表達下調(diào),導(dǎo)致裸鼠淋巴瘤移植瘤縮小。 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF),是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員,通過與其特異性受體TrkB結(jié)合,在神經(jīng)元存活、分化、和軸突延伸過程中起著非常關(guān)鍵的作用。研究表明,BDNF-TrkB信號通路不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長,而且還影響許多腫瘤,如肺癌,膀胱癌,胰腺癌等的發(fā)生、侵襲和預(yù)后。最近的一項研究表明,BDNF能增強移行細胞癌的增殖和存活。BDNF高表達與腫瘤(包括胰腺癌和乳腺癌)惡化有關(guān)。 順鉑是治療神經(jīng)母細胞瘤的有效藥物,它可以抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的生長,然而有關(guān)順鉑抗腫瘤作用的分子機制還不明確。在以往的研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-21的表達在順鉑治療后明顯下降,而miR-21又可以下調(diào)MSH2在細胞內(nèi)的表達水平,這一結(jié)果提示我們探討順鉑作用后引起的miRNA表達變化,并檢測下游分子的改變,能夠進一步明確順鉑抗癌機制,也為新型抗癌藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。基于miR-16和BDNF目前公認的作用,以及二者之間可預(yù)測的相關(guān)性,在本研究中,我們選擇miR-16和BDNF作為研究對象,來探討順鉑抗腫瘤作用的分子機制。 為了明確順鉑、miR-16和BDNF在神經(jīng)母細胞瘤內(nèi)的表達情況以及三者之間的相關(guān)性,本研究設(shè)計三部分實驗來進行：(一)研究順鉑抑制SH-SY5Y細胞生長及相關(guān)分子miR-16、BDNF的表達變化；(二)研究miR-16抑制SH-SY5Y細胞生長的機制；(三)研究順鉑對SH-SY5Y細胞移植瘤的抑制及影響機制。 第一部分順鉑抑制SH-SY5Y細胞生長及相關(guān)分子miR-16、BDNF表達變化的研究 目的： 研究順鉑對SH-SY5Y細胞生長的影響,闡明順鉑作用后miR-16和BDNF兩種分子在細胞內(nèi)的表達情況。 方法： 取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞接種到細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)過夜后,每孔加入不同劑量的順鉑,使培養(yǎng)基中的順鉑濃度分別為0μg/ml,1.5μg/ml；3μg/ml；4.5μg/ml;6μg/ml;12μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)48h后,分別進行如下實驗：放在倒置相差顯微鏡下,觀察細胞的狀態(tài)和數(shù)量；向培養(yǎng)孔內(nèi)加入MTT溶液,4h后棄掉培養(yǎng)基,每孔加100μl DMSO溶解結(jié)晶,570nm波長測量吸光度值,并計算細胞生長抑制率：使用Annexin V-FITC和PI對收集的細胞進行雙染,通過流式細胞儀檢測,分析不同濃度下各組的細胞凋亡率；收集順鉑作用后的SH-SY5Y細胞,提取細胞總RNA,并通過實時定量PCR檢測細胞內(nèi)miR-16的表達水平；提取細胞蛋白,進行電泳分離并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,用BDNF抗體進行雜交,再通過酶標的二抗使底物顯色,拍照后觀察BDNF在細胞內(nèi)的表達情況。 結(jié)果： 隨著順鉑濃度的增加,視野下可見的活細胞密度逐漸減少,而漂浮的死細胞數(shù)目增多,細胞密度降低；MTT結(jié)果顯示,當順鉑濃度達到6μg/ml時,細胞生長抑制率已超過一半,并且抑制率與順鉑的濃度呈正相關(guān)；通過流式細胞儀檢測,結(jié)果顯示,0gg/ml組細胞凋亡率明顯低于順鉑作用后的各組,并且隨著順鉑濃度的升高,細胞凋亡率逐步升高；實時定量PCR結(jié)果表明,順鉑作用后,SH-SY5Y細胞內(nèi)miR-16表達顯著升高；Western blotting測定細胞內(nèi)BDNF的表達,在順鉑濃度達到3μg/ml后,細胞內(nèi)BDNF的表達水平顯著降低。 結(jié)論： 順鉑可以抑制SH-SY5Y細胞的生長,引起細胞凋亡增加；同時,順鉑還可以使細胞內(nèi)miR-16表達升高；相反的,在順鉑作用后細胞內(nèi)BDNF的表達降低。 第二部分miR-16抑制(?)H-SY5Y細胞生長機制的研究 目的： 明確miR-16對SH-SY5Y細胞生長的影響,預(yù)測miR-16與BDNF的相關(guān)性,并證明miR-16對BDNF表達的影響。 方法： 化學(xué)合成miR-16的雙鏈寡核苷酸鏈,當培養(yǎng)板內(nèi)的SH-SY5Y細胞密度達到60%左右時,通過脂質(zhì)體法將miR-16或陰性對照的寡核苷酸轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi),更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后,進行后續(xù)實驗：在倒置相差顯微鏡下,觀察細胞的狀態(tài)和數(shù)量；通過MTT法測定各組細胞的吸光度值,并通過公式計算細胞生長抑制率；Annexin V-FITC和PI雙染后,通過流式細胞儀檢測miR-16誘導(dǎo)的細胞凋亡率；通過生物信息學(xué)分析,預(yù)測miR-16與BDNF的相關(guān)性；通過Western blotting技術(shù)檢測miR-16轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞后BDNF的表達水平。 結(jié)果： SH-SY5Y細胞在轉(zhuǎn)染miR-16后,細胞數(shù)量較正常對照和轉(zhuǎn)染NC組明顯減少,細胞密度降低,同時細胞形態(tài)也發(fā)生變化,貼壁程度有所減輕；MTT檢測細胞增殖抑制率,結(jié)果表明,較正常對照組和NC組,miR-16轉(zhuǎn)染組細胞增殖抑制率明顯升高(見圖7),經(jīng)統(tǒng)計學(xué)t檢驗分析,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。Annexin V-FITC/PI雙染后,轉(zhuǎn)染miR-16的實驗組細胞凋亡率達到33.7%,與對照組相比明顯升高；為了證實miR-16與BDNF之間的相關(guān)性,我們通過生物信息學(xué)分析的方法,發(fā)現(xiàn)在BDNF-3'-UTR存在miR-16的匹配位點；進一步通過Western blotting檢測,結(jié)果顯示,BDNF在miR-16作用后表達量明顯降低。 結(jié)論： miR-16可以發(fā)揮抑癌基因的功能,抑制細胞增殖,促進細胞凋亡；BDNF-3'-UTR區(qū)域存在miR-16的匹配位點；miR-16可以下調(diào)癌基因BDNF的表達而發(fā)揮作用。 第三部分順鉑對SH-SY5Y細胞移植瘤的抑制及機制研究 目的： 在個體水平,探討順鉑對裸鼠移植瘤生長的影響；進一步證明順鉑可以影響移植瘤細胞中miR-16和BDNF的表達,在個體水平證明順鉑可以升高miR-16的表達,而后者可進一步下調(diào)BDNF的表達。 方法： 大量培養(yǎng)SH-SY5Y細胞,準備注射到裸鼠背部皮下造模；通過腹腔注射戊巴比妥鈉使裸鼠麻醉后,每個點注射1×107個SH-SY5Y細胞；當腫瘤體積增大到大約100mm3時,對實驗組動物腹腔注射順鉑進行干預(yù),順鉑用量為3mg/kg,對照組腹腔注射等體積的生理鹽水；順鉑每四天注射1次,共治療4次；最后一次注射結(jié)束后的第四天,將裸鼠處死,然后將瘤體從背部皮下取出；將同組處理的瘤體放在一起觀察,拍照；用電子天平稱量每個瘤體的重量,記錄并計算均值；提取細胞RNA,通過實時定量PCR檢測瘤體細胞內(nèi)miR-16的表達水平；提取瘤體內(nèi)總蛋白后,進行電泳、轉(zhuǎn)印、抗體雜交等步驟,最后放入化學(xué)發(fā)光成像儀,拍照觀察蛋白條帶,分析BDNF在裸鼠移植瘤內(nèi)的表達情況。 結(jié)果： 注射SH-SY5Y細胞至裸鼠背部皮下后,每天觀察成瘤情況,并測量估算瘤體大��；約5-7天后,瘤體體積達到大約100mm3,開始使用順鉑對實驗組裸鼠進行干預(yù)；治療完畢,取出細胞移植瘤,可見順鉑處理組腫瘤體積明顯減小,順鉑在裸鼠體內(nèi)可以抑制SH-SY5Y細胞的增殖；使用精密電子天平稱量瘤體的重量,注射生理鹽水組的瘤重為0.135±0.015g,而順鉑干預(yù)后瘤重為0.057±0.018g；實時定量PCR檢測瘤體內(nèi)miR-16的表達,結(jié)果顯示與對照組相比,在順鉑干預(yù)后,瘤體內(nèi)miR-16表達顯著升高,這一結(jié)果與細胞水平的實驗結(jié)果是一致的；Western blotting檢鋇SH-SY5Y細胞移植瘤體內(nèi)BDNF的表達,發(fā)現(xiàn)在順鉑干預(yù)后,瘤體細胞內(nèi)BDNF的表達水平顯著減低。 結(jié)論： 順鉑可以抑制裸鼠SH-SY5Y細胞移植瘤的生長；順鉑可以增加瘤體細胞內(nèi)miR-16的表達水平,相反,瘤體內(nèi)BDNF的表達水平降低。 三部分整體結(jié)論： 順鉑可以抑制SH-SY5Y細胞的生長增殖,促進細胞的凋亡,也可以抑制SH-SY5Y細胞裸鼠移植瘤的生長；順鉑可以通過升高miR-16的表達發(fā)揮作用,而miR-16可以抑制細胞和裸鼠移植瘤體內(nèi)BDNF的表達；在細胞和個體水平,順鉑都能通過上調(diào)miR-16表達,進而下調(diào)BDNF表達,來發(fā)揮抑制細胞生長的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Mei Liu;Xin Zhang;Chen-Fei Hu;Qing Xu;Hong-Xia Zhu;Ning-Zhi Xu;;MicroRNA-mRNA functional pairs for cisplatin resistance in ovarian cancer cells[J];Chinese Journal of Cancer;2014年06期

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本文編號：1525709