本文關(guān)鍵詞： 藥物性肝損傷 對(duì)乙酰氨基酚 microRNAs 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) miRNA-122　出處：《上海醫(yī)藥工業(yè)研究院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景及目的在藥物研發(fā)過程中,藥物性肝損傷(Drug induced liver injury,DILI)是藥物開發(fā)終止的首要原因,也是藥物上市后被撤回的主要因素。因此,藥物性肝損傷已成為藥物在研究與開發(fā)階段最為關(guān)心的問題之一。目前DILI診斷的傳統(tǒng)生物標(biāo)志物有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、總膽紅素(TBIL)和堿性磷酸酶(ALP)等。但這些指標(biāo)反映的是已經(jīng)發(fā)生的肝損傷,并且也僅有40%的患者在DILI的早期階段出現(xiàn)異常。近年來(lái)研究比較熱門的生物標(biāo)志物micro RNAs(mi RNAs),尤其是肝臟組織特異表達(dá)的mi RNA-122,其特異性和敏感性均高于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物,并且已經(jīng)在臨床、臨床前和體外研究中得到證實(shí)。盡管多項(xiàng)研究均證實(shí)mi RNA-122可作為DILI的生物標(biāo)志物,但其在DILI中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究已有一定的工作基礎(chǔ),如SD大鼠DILI模型的建立已完成,在此基礎(chǔ)上旨在采用對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)誘導(dǎo)的SD大鼠DILI模型以及Hep G2細(xì)胞,通過mi RNA沉默及表達(dá)技術(shù),從整體、細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步研究mi RNA-122在DILI中的作用及其機(jī)制,為進(jìn)一步確立mi RNA-122作為DILI的生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。研究方法與結(jié)果本研究共分四個(gè)部分。第一部分:建立APAP誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型。通過CCK-8法檢測(cè)不同濃度APAP處理48 h對(duì)Hep G2細(xì)胞生存率的影響,確定APAP的IC50和IC75分別為7.5m M和20 m M。檢測(cè)7.5 m M和20 m M APAP處理3 h,6 h,12 h,24 h和48 h后對(duì)Hep G2細(xì)胞上清生化指標(biāo)活性的影響,包括AST、LDH。結(jié)果顯示,與溶媒對(duì)照組相比,20 m M APAP組在24 h和48 h AST升高為1.6倍和4.3倍,在6 h LDH活性升高2.0倍,從12 h開始,LDH活性持續(xù)升高到48 h。7.5 m M APAP組在48h AST和LDH活性有顯著性升高,分別升高1.7倍和2.1倍。細(xì)胞上清AST和LDH在不同濃度APAP暴露后的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴性,表明APAP誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型建立成功,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。第二部分:以APAP誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞損傷模型為基礎(chǔ),從體外研究考察mi RNA-122在APAP誘導(dǎo)體外肝細(xì)胞損傷中的作用。Hep G2細(xì)胞給予7.5 m M和20 m M APAP,給藥后3 h,6 h,12 h,24 h和48 h,提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,運(yùn)用RT-q PCR方法,檢測(cè)mi RNA-122表達(dá)水平。以mi RNA-122模擬劑(mi R-122 mimic)轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,用CCK-8方法檢測(cè)Hep G2細(xì)胞存活率。以mi RNA-122抑制劑和模擬劑轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞24 h后給予APAP處理24 h,用CCK-8方法檢測(cè)mi RNA-122沉默或者高表達(dá)對(duì)APAP誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞損傷的影響。與對(duì)照組相比,20 m M APAP組細(xì)胞內(nèi)mi RNA-122表達(dá)水平給藥后3 h升高2.82倍,24 h升高到2.97倍左右達(dá)到峰值,48 h幾乎恢復(fù)正常水平(0.71倍)。7.5m M APAP組細(xì)胞內(nèi)mi RNA-122表達(dá)水平12 h升高到2.1倍,24 h幾乎恢復(fù)正常水平(1.40倍)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,200 n M mi RNA-122 mimic組細(xì)胞存活率為84.4%,且有顯著性差異。結(jié)果顯示,與mimic NC+APAP相比,100 n M和200 n M mi RNA-122 mimic+APAP組細(xì)胞存活率分別降低10.3%和14.3%,且有顯著性差異。結(jié)果顯示,與LNA NC+APAP相比,20 n M LNA-antimi R-122+APAP組細(xì)胞存活率提高14.5%,且有顯著性差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,mi RNA-122在APAP處理后的Hep G2細(xì)胞中的表達(dá)有劑量和時(shí)間依賴性。在Hep G2細(xì)胞中,過表達(dá)的mi RNA-122顯著抑制細(xì)胞存活率。在APAP誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞損傷模型中,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,mi RNA-122上調(diào)能加重APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,mi RNA-122下調(diào)能減輕APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。第三部分:以雄性SD大鼠DILI損傷模型為基礎(chǔ),從體內(nèi)研究考察mi RNA-122在APAP誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)肝損傷中的作用。雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組,每組4只,分別先尾靜脈注射給予15 mg/kg LNA-antimi R-122(組3)、PBS(組2)、PBS(組1)各3天后,組3、組2、組1分別給予1250 mg/kg APAP、1250 mg/kg APAP以及0.5%CMC-Na,給藥12 h后麻醉解剖、通過血清生化指標(biāo)及肝臟組織病理學(xué)結(jié)果以確定mi RNA-122沉默是否會(huì)減輕或抵消APAP誘導(dǎo)的肝損傷。結(jié)果顯示,在LNA-antimi R-122+APAP組中,血清AST活性顯著低于NC+APAP組,下降倍數(shù)為1.7倍。盡管血清ALT活性下降倍數(shù)僅為1.1倍(無(wú)顯著性差異),但已有下降趨勢(shì)。并且在組織病理學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)LNA-antimi R-122+APAP組中炎癥、肝小葉中心的壞死組織顯著性低于NC+APAP組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明mi RNA-122下調(diào)能減輕APAP誘導(dǎo)SD大鼠肝損傷。第四部分:mi RNA-122在APAP誘導(dǎo)肝損傷作用中的潛在分子機(jī)制研究。應(yīng)用mi Randa、Target Scan、mi RBase預(yù)測(cè)軟件尋找mi RNA-122的靶基因,并與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果進(jìn)行比較,篩選出靶基因Bcl-w。Hep G2細(xì)胞給予20 m M APAP,給藥后3 h,6 h,12 h和24 h,提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染50 n M,100 n M和200 n M mi RNA-122 mimic與mimic NC,48 h后提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。RT-q PCR檢測(cè)靶基因Bcl-w的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20 m M APAP處理12 h和24 h后,可顯著性降低靶基因Bcl-w的表達(dá)水平,下降倍數(shù)分別為2.0和2.3倍。與mimic NC相比,100 n M和200 n M mi RNA-122 mimic可顯著性降低靶基因Bcl-w的表達(dá)水平,下降倍數(shù)分別為2.4和2.9倍。由此初步確認(rèn)了mi RNA-122通過抑制抗凋亡基因Bcl-w參與APAP誘導(dǎo)的肝損傷。結(jié)論1.確認(rèn)了細(xì)胞內(nèi)mi RNA-122的改變與APAP誘導(dǎo)的Hep G2細(xì)胞損傷密切相關(guān)。2.APAP誘導(dǎo)的肝損傷是通過mi RNA-122的高表達(dá)來(lái)介導(dǎo),且mi RNA-122通過抑制抗凋亡基因Bcl-w參與APAP誘導(dǎo)的肝損傷。
[Abstract]:In recent years , it has been proved that the effects and mechanisms of mi RNA - 122 on the survival rate of DILI are higher than those of traditional biomarkers . The results show that the IC50 and IC75 are 7.5m M and 20 m M respectively . The expression level of mRNA - 122 in vitro was determined by the method of CCK - 8 . The results showed that the survival rate of the cells increased by 14.5 % and 14.3 % , respectively , compared with the control group . The results showed that compared with the control group , the survival rate of the cells was increased by 14.3 % and 14.3 % , respectively . The results showed that compared with the control group , the survival rate of the cells was decreased by 10.3 % and 14.3 % , respectively . The results showed that the decrease of serum AST activity was significantly lower than that in NC + APAP group . The results showed that the expression of Bcl - w in the target gene was significantly lower than that in NC + APAP group . 1 . It was confirmed that the changes of mi RNA - 122 induced by APAP were closely related to APAP - induced liver injury .

【學(xué)位授予單位】：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳宇;藥物性肝損傷體外篩選模型和何首烏致肝損傷的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

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1 姜姍;缺氧對(duì)胎羊肝細(xì)胞發(fā)育及其RAS機(jī)制的影響[D];蘇州大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：1504820