本文關(guān)鍵詞： JIP3 海馬 學(xué)習(xí)記憶 條件性干擾小鼠　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景MAPK-JNK信號通路在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動及凋亡等多種生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。JIP家族(JNK-interacting protein family)在哺乳動物中有4個成員,包括JIP1、JIP2、JIP3和JIP4,他們都具有高度保守的JNK結(jié)合域,均在JNK信號通路激活過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。其中,JIP3最早是作為JNK3的結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)的。進(jìn)一步的研究則證實(shí)JIP3與JNK1,JNK2也有結(jié)合,但與JNK3的結(jié)合更強(qiáng)。JIP3與JNK的關(guān)系密切,其首先可以作為JNK信號通路的支架蛋白來增強(qiáng)JNK的激活;其次,其還可以作為JNK的底物,在被JNK磷酸化后接受JNK的調(diào)控。另一方面,在線蟲中JIP3的同源異構(gòu)體UNC-16和果蠅中JIP3的同源異構(gòu)體syd與驅(qū)動蛋白結(jié)合,作為運(yùn)輸貨物的調(diào)控蛋白,參與貨物的軸突運(yùn)輸。而在哺乳動物細(xì)胞中,JIP3也可以通過單獨(dú)或與JIP1合作的方式共同介導(dǎo)胞內(nèi)貨物的軸突運(yùn)輸。綜合以上細(xì)胞生物學(xué)水平的研究,我們了解到JIP3在細(xì)胞內(nèi)主要調(diào)節(jié)JNK信號通路的激活以及胞內(nèi)貨物的運(yùn)輸。那么其在動物的組織水平上發(fā)揮什么樣的的功能呢?首先,最近的一些研究證實(shí)JIP3對于個體發(fā)育十分重要:比如有研究檢測到JIP3在胚胎期第9-10天即開始有微弱的表達(dá),到胚胎期第13天其表達(dá)明顯升高,這提示JIP3可能參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。而早在2003年Kelkar等人即利用同源重組方式敲除JIP3第1號外顯子,從而破壞JIP3基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)JIP3-/-小鼠出生后致死,組織切片染色后觀察發(fā)現(xiàn)端腦連接缺失以及神經(jīng)元排列無序。這再次驗(yàn)證了 JIP3參與了小鼠的發(fā)育過程。為了縮小敲除JIP3的損傷,2007年Tronche等人采用Nestin-cre工具鼠與JIP3Flox/Flox雜交,發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)敲除JIP3也導(dǎo)致了出生后致死,端腦連接缺失。以上研究均證實(shí)JIP3對于小鼠的發(fā)育,特別是對大腦的發(fā)育具有至關(guān)重要的作用。更有意思的是,研究已證實(shí)在成年小鼠中JIP3在腦中的表達(dá)明顯高于其他器官,這提示JIP3在小鼠成年后的大腦中可能也發(fā)揮著重要作用。但是因?yàn)橹皣L試獲得成年JIP3敲除小鼠的努力均因小鼠發(fā)育異常導(dǎo)致的新生鼠致死而告失敗,所以目前對于JIP3在成年期小鼠中的功能研究尚無任何進(jìn)展。對于JIP3在成年期小鼠中功能的揭示,將為我們更加全面的理解JIP3的功能發(fā)揮重要作用。大腦是一個由多個功能性腦區(qū)有機(jī)組合而形成的一個精密組織,這些腦區(qū)既有功能分工,又在功能上相互制約,相互聯(lián)系,共同發(fā)揮著調(diào)控大腦功能的作用。海馬腦區(qū)作為主要負(fù)責(zé)認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶及情緒的重要腦區(qū)。在解剖學(xué)層次上,海馬可以分為CA1,CA3和DG,它們構(gòu)成神經(jīng)環(huán)路共同行使海馬功能。我們的研究發(fā)現(xiàn),JIP3在成年小鼠的海馬腦區(qū),尤其是海馬的CA1及DG的突觸形成部分集中分布,并且在興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元中均有分布,提示其與該部分腦區(qū)的功能有關(guān)。進(jìn)一步的,我們檢測了正常小鼠在經(jīng)過條件性恐懼記憶和水迷宮訓(xùn)練之后的表達(dá)變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠在經(jīng)過上述兩種行為學(xué)范式訓(xùn)練之后,其背側(cè)海馬中JIP3的表達(dá)明顯升高,而腹側(cè)海馬的JIP3表達(dá)量則無變化,這提示JIP3參與了海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶過程。為了證實(shí)JIP3是海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的必要條件,我們采用腦立體定位注射在小鼠的海馬腦區(qū)注射JIP3的干擾病毒實(shí)驗(yàn)研究其是否影響成年小鼠的學(xué)習(xí)記憶情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾JIP3病毒注射后,小鼠的條件性恐懼記憶能力及空間學(xué)習(xí)記憶能力都受損了,這提示JIP3對于小鼠海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶能力是必須的�？紤]到病毒注射的有創(chuàng)性及精準(zhǔn)性不足的缺點(diǎn),我們已制作完成JIP3的條件性敲除小鼠,下一步擬利用該小鼠與相應(yīng)Cre老鼠雜交,進(jìn)一步證實(shí)JIP3對于海馬依賴學(xué)習(xí)記憶的作用。目的:探究JIP3是否影響成年小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為。方法:1、蛋白提取及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)取小鼠不同腦區(qū)的組織樣本,經(jīng)過蛋白裂解后提取蛋白并通過免疫印跡方法進(jìn)行檢測,最后用軟件Quantity One進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2、免疫組織化學(xué)染色在JIP3不同腦區(qū)分布的研究中,我們首先用5%的水合氯醛深度麻醉成年小鼠,依次經(jīng)過生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛固定,進(jìn)一步的后固定和蔗糖脫水。腦經(jīng)過冠狀切用于免疫組織化學(xué)染色,JIP3抗體濃度為1:500。最后在熒光顯微鏡下拍照。3、免疫細(xì)胞化學(xué)染色在JIP3在哪種類型細(xì)胞中分布的研究中,我們首先體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,接下來進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,JIP3、Camkii、Gad67一抗?jié)舛染鶠?:200,最后在倒置熒光顯微鏡下拍照。4、腦立體定位和病毒微量注射5%水合氯醛腹腔注射到小鼠體內(nèi),麻醉后固定在腦立體定位儀上。選擇背側(cè)海馬注射病毒,注射的坐標(biāo)為:后1.82毫米,左右±1.5毫米,深度-2.5毫米。5、行為學(xué)測試5.1曠場實(shí)驗(yàn)為檢測小鼠的自主運(yùn)動能力和是否產(chǎn)生焦慮樣行為。將小鼠放在曠場中央?yún)^(qū),用Smart軟件記錄小鼠在曠場中10分鐘的自由活動情況,分析這10分鐘總的運(yùn)動距離來評價小鼠自主運(yùn)動能力,分析在中央?yún)^(qū)時間的比例來作為評價小鼠焦慮樣行為的指標(biāo)。5.2條件性恐懼記憶為檢測JIP3干擾病毒是否影響小鼠的恐懼記憶。在訓(xùn)練小鼠足底電擊刺激產(chǎn)生的恐懼記憶后24小時,再檢測小鼠在無電擊刺激的情況下的不動時間來作為檢測小鼠恐懼記憶能力的指標(biāo)。5.3水迷宮將小鼠放有四個象限的水池中,每天訓(xùn)練四個象限各一次,共訓(xùn)練5天。在第6天,撤掉平臺,檢測小鼠在目的象限中停留的時間以及穿梭的次數(shù)來評價小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。6、JIP3條件性干擾小鼠的制作及鑒定按照文獻(xiàn)的方法及分子克隆技術(shù)制作插入片段,然后交由上海同濟(jì)大學(xué)動物中心制作JIP3條件性敲除小鼠。小鼠出生后首先通過PCR鑒定鼠尾基因組中外源片段的插入情況,然后再待其成年后與Emx-1-Cre小鼠雜交,利用蛋白免疫印跡測定其陽性子代腦組織蛋白中JIP3的表達(dá)變化情況。另外,我們還進(jìn)一步通過尼氏染色及腦體積觀察分析了 JIP3條件性敲除小鼠的形態(tài)變化。結(jié)果:1、JIP3在成年小鼠海馬的CA3和DG腦區(qū)的興奮性和抑制性神經(jīng)元中有大量分布為了研究JIP3在成年小鼠腦中的功能,我們首先提取了包括皮層、海馬、中腦和小腦在內(nèi)的幾個主要的腦區(qū)組織樣本的裂解液,然后通過蛋白免疫印跡的方法檢測不同腦區(qū)中JIP3的表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)JIP3在幾個腦區(qū)中均有表達(dá),但在海馬中的表達(dá)明顯高于其他腦區(qū)。接下來我們又通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測了 JIP3在海馬各亞腦區(qū)的分布情況,結(jié)果表明JIP3主要集中在CA3、DG亞區(qū)突觸形成的部位。最后我們通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測到JIP3在CaMKII陽性的興奮性神經(jīng)元及GAD67陽性的抑制性神經(jīng)元中均有分布。上述結(jié)果證實(shí)JIP3主要分布在成年小鼠海馬的CA3和DG腦區(qū)的興奮性和抑制性神經(jīng)元中,提示其與海馬依賴的動物行為可能存在一定的關(guān)系。2、JIP3參與背側(cè)海馬恐懼記憶和空間記憶為了檢測JIP3是否參與,以及參與了哪些海馬依賴的動物行為過程,我們首先利用正常小鼠進(jìn)行足底電擊的恐懼性記憶訓(xùn)練,然后利用蛋白免疫印跡的方法檢測JIP3的表達(dá)是否發(fā)生變化。結(jié)果表明背側(cè)海馬中的JIP3在訓(xùn)練后有明顯升高,而腹側(cè)海馬的JIP3沒有變化。這個結(jié)果提示JIP3可能參與海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶行為。在此基礎(chǔ)之上,我們進(jìn)一步采用了另外一種海馬依賴學(xué)習(xí)記憶范式水迷宮實(shí)驗(yàn)對該現(xiàn)象進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練三天后,JIP3在背側(cè)海馬的表達(dá)同樣有明顯升高,證實(shí)了 JIP3參與了海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶。3、JIP3對于海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶是必須的為了檢測JIP3在海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶的必要性,我們通過在小鼠背側(cè)海馬中注射JIP3干擾病毒來檢測JIP3表達(dá)降低后對小鼠學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生了什么樣的影響。在包好干擾JIP3的慢病毒之后,我們利用腦立體定位注射將病毒打入小鼠的背側(cè)海馬JIP3表達(dá)豐富的CA3和DG腦區(qū)中間,在這兩個亞腦區(qū)同時降低JIP3的表達(dá)。在病毒表達(dá)兩周后,我們利用這些動物進(jìn)行動物行為學(xué)測試。首先我們通過曠場實(shí)驗(yàn)檢測了打入病毒后是否影響小鼠的自主運(yùn)動能力和情緒,結(jié)果證實(shí)打入干擾JIP3的病毒不影響小鼠的運(yùn)動能力和情緒。在此基礎(chǔ)之上,我們又通過條件性恐懼記憶和水迷宮兩個行為學(xué)范式檢測了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力是否受JIP3干擾的影響。結(jié)果表明,CA3和DG腦區(qū)干擾JIP3將損傷小鼠的恐懼學(xué)習(xí)記憶能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力,提示JIP3對于海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶行為是必須的。4、條件性干擾JIP3轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及鑒定因?yàn)镴IP3敲除鼠包括全身敲和局部腦區(qū)敲除都出現(xiàn)了小鼠出生致死的現(xiàn)象,使得無法研究成年期的功能。因此,我們采取在特定腦區(qū)條件性干擾JIP3的表達(dá)的方法,獲得了可正常發(fā)育到成年的JIP3敲除小鼠,從而使得進(jìn)一步研究JIP3在成年期的功能成為了可能。結(jié)論:1、JIP3在海馬CA3和DG腦區(qū)的興奮性和抑制性神經(jīng)元中廣泛分布。2、JIP3參與小鼠海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶行為。3、JIP3對于小鼠海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶行為是必須的。創(chuàng)新點(diǎn):1、首次證實(shí)JIP3在成年小鼠中參與海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶行為2、首次獲得了可正常發(fā)育至成年的JIP3條件性干擾小鼠,使進(jìn)一步研究JIP3在成年期的功能成為了可能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q42

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