發(fā)布時間：2018-02-04 16:05

  本文關(guān)鍵詞： 減阻劑 聚氧化乙烯 超聲造影 缺血 血管新生 作用機制　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 周圍動脈疾病(Peripheral arterial disease,PAD)指外周動脈狹窄或閉塞引起的肢體缺血性疾病。主要包括：下肢動脈硬化閉塞、糖尿病足、血栓性脈管炎等,是一種較常見的致殘性疾病。隨著我國飲食結(jié)構(gòu)的改變(攝入含脂食物增多)、生活工作節(jié)奏加快、人均壽命延長,PAD發(fā)病率逐年升高,己經(jīng)成為危害人類健康的嚴(yán)重疾病。目前PAD的主要治療手段包括：戒煙調(diào)脂、控制血糖血壓、抗血小板藥物治療等；對于癥狀嚴(yán)重的患者,經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)及外科手術(shù)成為一種治療選擇,但是對于血管病變彌漫、尤其是合并糖尿病的患者往往沒有手術(shù)機會,仍缺乏令人滿意的治療方法。繼續(xù)探尋新的PAD治療手段有重要的臨床意義及社會價值。 血管發(fā)生(neo vascularization)包含血管新生(angiogenesis)和小動脈形成(arteriogenesis)。血管新生(angiogenesis)是指血管網(wǎng)上芽生出來毛細(xì)血管,缺血、缺氧能夠促進(jìn)血管新生；而血流切應(yīng)力(fluid shear stress,FSS)是動脈生成的一個重要始動因素。FSS是指在血液流動方向的切平面上,血液與血管壁之間的相互作用力。在豬急性股動脈閉塞的模型中,在閉塞遠(yuǎn)端人為造成動-靜脈瘺,可以促進(jìn)更多側(cè)支循環(huán)的建立,在改善局部缺血組織血供明顯優(yōu)于促血管生長因子的作用,這證明缺血組織的血流切應(yīng)力的持續(xù)增加能夠顯著促進(jìn)局部小動脈形成。動脈生成表現(xiàn)為小動脈直徑和數(shù)目的增加,這個過程是通過內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的增殖而不僅僅是簡單的血管擴張,其中肌動蛋白Cofilinl和Cofilin2參與平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖,循環(huán)中的單核細(xì)胞對動脈生成的過程至關(guān)重要。鑒于血流切應(yīng)力增加是動脈生成的一個重要始動因素,那么增加血流切應(yīng)力的藥物將可能是治療組織缺血的一個重要治療環(huán)節(jié)。 在不改變驅(qū)動壓的情況下,向流體中加入極少量的某些高分子聚合物后,流體的粘滯度和密度無明顯改變,但流體阻力明顯降低,流速增加。這種現(xiàn)象稱為Tom's效應(yīng)(Tom's effect),而這些高分子聚合物常被稱為“減阻劑”(Drag reducing polymers,DRPs)。近年來減阻劑在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注,已先后證明減阻劑“聚氧化乙烯(polyethylene,PEO)"能夠明顯減少大鼠血管阻力,增加微動脈、靜脈和毛細(xì)血管的紅細(xì)胞速度。本課題組亦通過聲學(xué)造影證實PEO可降低大鼠肢體循環(huán)阻力,當(dāng)股動脈急性閉塞后,減阻劑仍可明顯改善缺血肢體局部血流灌注狀態(tài)表明DRPs可以提高缺血組織的血供狀況,為急性缺血疾病治療提供新的思路,并為進(jìn)一探討DRPs恢復(fù)慢性缺血組織血供提供了基礎(chǔ)。目前已有實驗證明,減阻劑通過增加血流切應(yīng)力可明顯減少豬、兔等主動脈粥樣斑塊的形成,那么它能否通過增加血流切應(yīng)力等途徑促進(jìn)血管新生呢?在血管新生的過程中,DRPs又是通過什么樣的作用機制來實現(xiàn)這一過程的呢? 本實驗擬采用大鼠慢性后肢缺血模型,結(jié)合血流動力學(xué)監(jiān)測、對比超聲聲學(xué)造影成像技術(shù)及病理、免疫組化、microCT、Real-time PCR及掃描電鏡技術(shù),力圖證明“減阻劑”可促進(jìn)動脈生成(arteriogenesis)、改善缺血組織預(yù)后,并探討其可能的機制,為建立缺血疾病治療新手段奠定基礎(chǔ)。 第一部分減阻劑對大鼠慢性后肢缺血腹主動脈血流量及后肢阻力血流動力學(xué)的影響 目的 評價周期性治療后PEO對慢性后肢缺血大鼠腹主動脈血流量及后肢循環(huán)阻力的影響,確定減阻的能效關(guān)系,為進(jìn)一步開展減阻劑在慢性給藥模型研究中奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。 方法 1.減阻劑的制備 結(jié)合本課題組既往研究基礎(chǔ)及國外相關(guān)研究報告,本實驗選擇的減阻劑種類為聚氧化乙烯(Polyethylene oxide,PEO,平均分子量為5×106Da)。稱取PEO100mg,加入生理鹽水100ml(濃度為0.1%,即質(zhì)量濃度為1000ppm)：磁力攪拌器置入燒杯中勻速(60r/min)攪拌24h；分子截留量為50000Da的透析袋中透析24h；0.2μm的無菌過濾器過濾細(xì)菌及雜質(zhì)；稀釋為50ppm的溶液備用。 2.動物模型的制備 采購大鼠后,適應(yīng)性飼養(yǎng)飼養(yǎng)1周。將實驗大鼠按照完全隨機的方法分為實驗組及對照組,每組8只。 建立大鼠慢性靜脈給藥模型：3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,右側(cè)頸部切口,分離頸靜脈,插入PE50管約1cm至右心房出口,用探針將PE50管經(jīng)皮下隧道引導(dǎo)至背部切口,固定,1cm的細(xì)鋼絲封堵PE50管末端。分籠飼養(yǎng),每日予肝素生理鹽水(10IU/ml×0.1ml)沖管。 建立大鼠右側(cè)后肢缺血模型：沿大鼠右側(cè)后肢腹股溝韌帶切口,分離股動脈及其分支,并以5-0絲線在旋髂淺動脈之上雙線結(jié)扎股動脈主干,避免傷及靜脈及神經(jīng)。左側(cè)后肢不做處理,作為自身內(nèi)對照。 給藥方式：缺血后當(dāng)日開始在清醒自由活動狀態(tài)下通過頸靜脈通道給藥,隔日一次,連續(xù)給藥21天,實驗組予PEO(50ppm,0.8-1.2ml/h,30min)給藥速度根據(jù)大鼠體重的6%計算血容量,使血藥濃度達(dá)到2μg/ml,對照組以相同條件給予生理鹽水。 3.血流動力學(xué)監(jiān)測 給藥后第21天行腹正中切口,分離腹主動脈,安置11ransonic超聲血流儀于髂總動脈分叉處上方約5mm處,監(jiān)測腹主動脈血流。經(jīng)右側(cè)股動、股靜脈逆行插管至髂總動脈分叉處,監(jiān)測髂動脈及髂靜脈壓力。后肢循環(huán)阻力通過公式：阻力=(髂動脈壓力一髂靜脈壓力)/腹主動脈血流量,即R=△P/Flow來估算。結(jié)果 1、兩組大鼠腹主動脈血流量存在交互效應(yīng)(F=3.076,P=0.000,提示兩組間差異在不同時間下存在不同；組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.196,P=0.000),提示不同處理組的效果有差異；各時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.47,P=0.000)提示在不同時間下兩組比較血流量不同。 進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)：基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大鼠腹主動脈血流量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(4.47±0.60vs4.47±0.95ml/min,t=0.016,P=0.988).減阻劑組腹主動脈血流量在給藥過程中明顯增加,約8min達(dá)到峰值,并維持一個平臺,隨后緩慢下降,各時間點血流量變化有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.995,P=0.000)。鹽水組在給藥過程中腹主動脈血流量變化無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.158,P=1.000) 2、兩組大鼠后肢循環(huán)阻力不存在交互效應(yīng)(F=1.117,P=0.359);組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.17,P=0.000),提示不同處理組的效果有差異；各時間點差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.165,P=0.135)提示在不同時間下后肢循環(huán)阻力沒有顯著性變化。 進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn),基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組大鼠后肢循環(huán)阻力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.44±0.10Vs0.43±0.04mmHg·min/ml,t=0.29,P=0.78).PEO組減阻效果明顯,后肢循環(huán)阻力在給藥過程明顯降低,約14-18min達(dá)到最大效應(yīng),并維持穩(wěn)定,停藥后緩慢恢復(fù),各時間點阻力變化沒有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.632,P=0.173)。鹽水組在給藥過程中后肢循環(huán)阻力變化不大,無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.216,P=0.95)。 結(jié)論 減阻劑PEO能夠增加大鼠慢性缺血后肢模型腹主動脈血流量,增加局部血流,同時降低大鼠后肢循環(huán)阻力。 第二部分：減阻劑對大鼠慢性缺血后肢血管新生的影響 目的 1.應(yīng)用超聲造影評價微循環(huán)的方法,觀察PEO對慢性缺血骨骼肌微循環(huán)的作用,并結(jié)合病理、免疫組化及microCT技術(shù)從不同角度評價減阻劑對大鼠慢性下肢缺血模型血管新生的影響。 2.以鹽水組為對照,評價PEO治療組對缺血肢體毛細(xì)血管和小動脈的不同影響,探討血管新生(angiogenesis)和動脈形成(arteriogenesis)在PEO促新血管生成過程中的不同作用。 方法 1.減阻劑的制備、動物模型的建立及給藥方式同第一章。 2.聲學(xué)造影評價大鼠后肢骨骼肌微循環(huán)及數(shù)據(jù)分析 使用Sequoia512超聲心動圖儀,于術(shù)前0天及術(shù)后第1、7、14、21天行對比超聲評價大鼠缺血側(cè)后肢的微循環(huán)灌注情況。超聲探頭固定于大鼠后肢中部短軸切面,采用相干脈沖序列成像技術(shù)(coherent pulse sequence,CPS),時間觸發(fā)成像取圖。連續(xù)錄取造影劑再充盈至穩(wěn)態(tài)過程的全部動態(tài)資料。脫機使用MCE軟件分析圖像,記錄A、p及A×β值。根據(jù)造影劑在局部組織的聲強度與時間間隔的函數(shù)關(guān)系Y=A(1-e(-β*t))超聲微泡的再灌注充填曲線。造影劑再充填速率(p),反映的是微泡在局部組織毛細(xì)血管流動的速度；骨骼肌的平臺聲強度(A),反映的是局部微循環(huán)血流容積；兩者乘積Axp也就反映局部組織血流量。 3.病理學(xué)檢測 于術(shù)前0天,第7天,第14天及第21天分別處死動物,取下右側(cè)后肢內(nèi)收肌,行HE染色、α-actin抗體及CD31抗體免疫組化染色。 4. Micro CT血管造影 術(shù)后第21天,對兩組大鼠腹腔麻醉,近端結(jié)扎腹主動脈近腎動脈側(cè),向遠(yuǎn)端插入PE50管至髂總動脈開口處,經(jīng)PE50管向腹主動脈遠(yuǎn)端推注硝酸甘油200mg,1min后以60%含碘造影劑(碘海醇)3ml手動推入。用中科愷盛公司X-線成像系統(tǒng)對左髂總動脈至肢體末端的測值循環(huán)血管進(jìn)行成像。取缺血肢體中部進(jìn)行圖像保存并進(jìn)行定量分析。使用Image J軟件對血管積分進(jìn)行分析,血管積分=缺血側(cè)總造影劑血管充填長度/非缺血側(cè)總造影劑血管充填長度。 結(jié)果 1.PEO組血流灌注恢復(fù)速度顯著快于鹽水組。在第14天時,PEO組的血流量(A×β)恢復(fù)已經(jīng)顯著快于鹽水組(4.94±0.82vs3.46±1.13,t=2.596, P=0.027).治療21天時,PEO組大鼠缺血后肢的血流量高于鹽水對照組,PEO組的血流恢復(fù)到術(shù)前的(90.9±17.9)%,而鹽水組僅恢復(fù)到(73.3±29.4),兩組比較有顯著性差異(5.57±1.15vs4.09±1.04dB/s,t=2.343, P=0.001);骨骼肌血流容積(A)較生理鹽水組各時間點比較無明顯改變((F=0.045,P=0.836)；血流速度(β)呈現(xiàn)與血流量(A×β)相似變化趨勢,在第14天及21天時與鹽水組比較明顯升高,分別為和(0.22±0.04vs0.16±0.04s-1, t=2.666, P=0.024)(0.26±0.05vs0.19±0.05s-1,t=2.734, P=0.021)差異有顯著性意義。 2.HE染色提示：大鼠缺血后肢骨骼肌細(xì)胞形態(tài)正常,無充血、水腫,PEO組及鹽水組的骨骼肌細(xì)胞中均有炎癥細(xì)胞浸潤,PEO組炎癥細(xì)胞浸潤細(xì)胞較鹽水組明顯。 3. a-actin免疫組化示PEO組的小動脈個數(shù)在第7天時與生理鹽水組未見顯著性差異(29.83±6.8vs27.42±5.72,t=0.666, P=0.52),第14天及21天時較鹽水組增加,分別為(40.78±5.45vs33.01±4.66個/mm2,t=2.653, P=0.024)和(47.10±6.04vs43.18±6.47個/mm2,t=2.588,P=0.027) 4.CD31毛細(xì)血管密度提示：治療7天時,PEO組陽性染色毛細(xì)血管數(shù)明顯增加,與術(shù)前相比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(359.17±21.74vs312.33±21.42, P=0.006),術(shù)后14天呈現(xiàn)緩慢回落趨勢,到第21天監(jiān)測A值與術(shù)前相比較無統(tǒng)計學(xué)差異(314.17±26.19vs312.33±21.42,P=0.906)。生理鹽水組與PEO組毛細(xì)血管密度變化趨勢基本一致。兩組之間各個時間點比較未見顯著性差異(P0.05)。 5.‘CT造影示治療21天后,PEO組側(cè)支血管血管積分較生理鹽水組增加(1.42±0.16vs1.16±0.16,t=2.83,P=0.018),兩組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1.PEO能夠促進(jìn)大鼠慢性缺血后肢骨骼肌血流灌注,增加血流速度,結(jié)合病理學(xué)及micro CT下肢血管造影,證明減阻劑PEO可以促進(jìn)缺血后側(cè)支循環(huán)血管形成過程,并可能為治療周圍血管疾病提供了一種的新型安全有效手段。 2.PEO能夠促進(jìn)缺血下肢血管新生,其形式主要通過促進(jìn)小動脈生成,而非促進(jìn)毛細(xì)血管新生來這一過程來實現(xiàn)的。 第三部分減阻劑對慢性大鼠下肢缺血血管新生的可能機制 目的 采用RT-PCR及掃描電鏡評價減阻劑PEO對慢性缺血大鼠后肢Cofilinl和Cofilin2基因、單核細(xì)胞粘附因子(MCP-1)及單核細(xì)胞的粘附能力的影響,進(jìn)一步探討PEO促進(jìn)血管新生的可能機制。 方法 1.減阻劑的制備、動物模型的建立及給藥方式同第一章。 2.肌肉Cofilin1mRNA及Cofilin2mRNA表達(dá)的測定 治療第21天后,收集肌肉組織標(biāo)本,Cofilin1mRNA. Cofilin2mRNA的表達(dá)量采用實時熒光定量(RT-PCR)進(jìn)行相對定量檢測(以2-△△CT表示)。 3.肌肉MCP-1mRNA表達(dá)的測定同本部分Cofilin1mRNA及Cofilin2mRNA的測定方法。 4.掃描電鏡：治療21天時,取結(jié)扎段以下5mm處動脈標(biāo)本,縱行剖開展平生理鹽水沖洗去除表面附著物后,置于戊二醛固定液中,以備制作電鏡標(biāo)本用。掃描電鏡下觀察、拍照。 結(jié)果 1.PEO組肌肉Cofilin1mRNA與生理鹽水組相比較表達(dá)顯著升高(1.81±0.69vs1.00±0.00,t=2.88, P=0.035),兩組比較有顯著性差異。 2.與生理鹽水組相比較PEO組肌肉Cofilin2mRNA的表達(dá)降低(0.64±0.33vs1.00±0.00,t=2.62,P=0.026),兩組比較有顯著性差異。 3.PEO組肌肉MCP-1mRNA與生理鹽水組相比的表達(dá)增加(2.01±0.57vs1.11±0.42,t=3.09,P=0.01),兩組比較有顯著性差異。 4.掃描電鏡示PEO治療組表面見大量單核細(xì)胞粘附,聚集成團(tuán),可見部分單核細(xì)胞侵入內(nèi)膜中層。鹽水組：其表面可見單核細(xì)胞及細(xì)胞碎片粘附,未見成團(tuán)聚集單核細(xì)胞。 結(jié)論 1.減阻劑能夠上調(diào)Cofilin1mRNA的表達(dá),下調(diào)Cofilin2mRNA表達(dá),其促進(jìn)大鼠慢性缺血下肢血管新生的作用可能通過參與平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖,促進(jìn)側(cè)枝血管發(fā)育和成熟的過程。 2.減阻劑可能通過提高切應(yīng)力介導(dǎo)的生物-機械力作用,作用于內(nèi)皮細(xì)胞,提高M(jìn)CP-1的表達(dá),提高單核細(xì)胞的粘附和侵入能力,以此促進(jìn)血管新生的過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R543.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡鋒;杜榮生;查道剛;陳向輝;李勝輝;周冰潔;劉伊麗;;聚氧化乙烯對大鼠腹主動脈血流量及下肢循環(huán)阻力的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年04期

2 杜榮生;查道剛;周冰潔;胡鋒;紀(jì)麗景;吳爵非;賓建平;劉伊麗;;聚環(huán)氧乙烷對大鼠提睪肌微循環(huán)紅細(xì)胞流速的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年05期

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本文編號：1490590