發(fā)布時間：2018-02-04 12:07

  本文關(guān)鍵詞： 多發(fā)性硬化 EAE 馬索羅酚 丹參酮ⅡA Nrf2 HO-1 MDA　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是一種主要病理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘的自身免疫疾病，好發(fā)病于中青年人，多發(fā)于女性。由于患者常遺留神經(jīng)功能缺損，造成生活工作上的不便，甚至喪失工作能力，給個人、家庭和社會帶來巨大的損失，因此科研工作者一直在尋找有效的治療藥物。本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）小鼠來進(jìn)行研究，大多數(shù)研究人類多發(fā)性硬化的學(xué)者都認(rèn)為EAE是理想的動物模型，已有研究證實(shí)萊菔硫烷對EAE小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能是通過激活了Nrf2/ARE通路，使機(jī)體對氧化應(yīng)激的抵抗能力增強(qiáng)。但萊菔硫烷不能應(yīng)用于人體，我們查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)甲二氫愈創(chuàng)木酸、又稱為馬索羅酚（Nordihydroguaiaretic acid，NDGA）和丹參酮ⅡA（TanshinoneⅡA）這兩種Nrf2/ARE通路的激活劑，其中馬索羅酚以往曾作為食物的防腐添加劑使用，丹參酮ⅡA是已在臨床使用的藥物，將這兩種藥物作為實(shí)驗(yàn)干預(yù)藥物，為臨床用藥進(jìn)行初步篩選。與以往實(shí)驗(yàn)在造模當(dāng)天即給予干預(yù)藥物不同，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M患者“發(fā)病-就診-治療”的診治過程，在小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀后才給予干預(yù)藥物，更具有臨床實(shí)踐意義。本實(shí)驗(yàn)研究了馬索羅酚和丹參酮ⅡA對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，以及這種保護(hù)作用的作用機(jī)制，從個體、細(xì)胞、分子角度初步探討這兩種藥物應(yīng)用于多發(fā)性硬化的臨床治療的可能性，從而為臨床治療提供新的思路，初步篩選藥物。 方法： 1分組：入選的小鼠為健康雌性C57BL/6小鼠、8-10周齡、體重為18-20g，共27只小鼠，將其隨機(jī)分為DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組，每組各9只。 2制備EAE小鼠模型所使用的藥物：使用無菌的生理鹽水將MOG35-55稀釋成5mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑，使其比例為1∶1，從而使結(jié)核桿菌的最終濃度為4mg/ml充分乳化。使用乙醚麻醉后固定小鼠，在小鼠脊柱旁雙側(cè)分四點(diǎn)進(jìn)行皮下注射乳化混合物各0.025ml，每只小鼠共0.1ml,于免疫當(dāng)天（第0小時）腹腔注射500ng PTX及第二天（第48小時）再次腹腔注射等量PTX，每只小鼠共1000ng PTX。 3干預(yù)處理：小鼠自發(fā)�。ㄔu分≥1分）當(dāng)天，DMSO組每只每日腹腔注射5%DMSO1ml/mg（5%二甲基亞砜即DMSO是配置NDGA及丹參酮ⅡA溶液的溶劑），NDGA組每只每日腹腔注射NDGA溶液10mg/kg，丹參酮ⅡA組每只每日腹腔注射丹參酮ⅡA溶液20mg/kg。 4神經(jīng)系統(tǒng)功能評分：由兩名觀察者選用雙盲法，逐日早8∶00和晚16∶00兩次，對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。至DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組小鼠發(fā)病后20天。神經(jīng)功能評分選用Weaver’s（15）評分標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)較5分法及7分法更為細(xì)致。 5腦組織MDA含量測定：按照每只小鼠處死的時間，斷頸處死小鼠，在冰盤上取出腦組織，迅速剝除硬腦膜，在冰盤上將腦組織分為額極、腦室周和小腦三部分，選取腦室周圍腦組織，用4攝氏度生理鹽水洗去血液，濾紙吸干，稱取重量，按照1:9的比例加入4攝氏度生理鹽水，超聲勻漿,設(shè)定2000r/min，在4攝氏度下，共離心15分鐘，抽取上清液，置于-80攝氏度保存，待測。測量時嚴(yán)格按照丙二醛試劑盒說明書操作。 6腦組織表達(dá)Nrf2、HO-1含量測定：按照每只小鼠處死的時間，水合氯醛麻醉后，固定小鼠，進(jìn)行左心室穿刺，使用生理鹽水灌出血液，使用4%多聚甲醛固定組織，固定2小時后取腦組織。將腦組織浸泡在多聚甲醛中為充分固定腦組織，將腦組織在多聚甲醛中浸泡24小時，行石蠟包埋，以5um厚度切取組織切片，進(jìn)行免疫組化染色，之后使用光學(xué)顯微鏡觀察陽性細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。 結(jié)果： 1臨床表現(xiàn)： 神經(jīng)功能評分：DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組分別為2.50±0.40、1.25±0.29、1.33±0.19，NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2腦組織中MDA含量：DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組在發(fā)病20天時含量分別為41.05±8.23、23.28±3.02、27.03±3.51（單位為nmol/mgprot），NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3腦組織中Nrf2表達(dá)量：DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組在發(fā)病20天時Nrf2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為19.13±2.81、84.41±3.48、76.15±3.18（單位為個/高倍視野），NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4腦組織中HO-1表達(dá)量：DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組在發(fā)病20天時HO-1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為21.46±2.86、86.04±11.22、83.00±8.76（單位為個/高倍視野），NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： 1NDGA和丹參酮ⅡA可以減輕EAE小鼠的神經(jīng)功能損傷。 2NDGA和丹參酮ⅡA可能是通過抗氧化對EAE小鼠起到神經(jīng)保護(hù)作用。 3NDGA和丹參酮ⅡA的抗氧化作用可能是因?yàn)榧せ盍薔rf2通路，使HO-1表達(dá)增加。
[Abstract]:Objective: multiple sclerosis (multiple sclerosis MS) is one of the main pathological features of central nervous system white matter demyelination autoimmune diseases, incidence in young people, more to female. Because patients often left neurological defect, resulting in the life and work, and even the loss of ability to work, to person, cause huge loss of family and society, so researchers are looking for effective drug treatment. This experiment using the experimental autoimmune encephalomyelitis (Experimental autoimmune, encephalomyelitis, EAE) mice to study, most of the studies of human multiple sclerosis scholars believe that EAE is an ideal animal model, research that sulforaphane has neuroprotective effect on EAE mice, this protective effect may be through the activation of the Nrf2/ARE pathway, enhance the body resistance to oxidative stress but ability. Sulforaphane can not be applied to the human body, we found a literature two hydrogen nordihydroguaiaretic acid, also known as horse Solo (Nordihydroguaiaretic acid, NDGA phenol) and tanshinone A (Tanshinone II A) activation of the two Nrf2/ARE pathway, which Maso Lo had used as food preservative, tanshinone A is already in clinical use of the drug, the two drugs as experimental drug intervention, were screened for clinical medication. In the previous experimental and modeling on the day of the intervention process simulation of different drugs, patients "morbidity treatment - treatment of the experimental treatment, neurological function in mice after treated drug intervention, has more clinical practice significance. This experiment studied the neuroprotective effect of horse solo phenol and tanshinone A on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice, and the protective effect of machine From the perspective of individuals, cells and molecules, we preliminarily discussed the possibility of clinical application of these two drugs for multiple sclerosis, so as to provide new ideas for clinical treatment, and initially screen drugs.
Method錛，

本文編號：1490169