本文關(guān)鍵詞： 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 葡萄糖 衰老 凋亡 自噬 甘露醇 RAS 線粒體 Ang Ⅱ Benzepril Losartan 自噬 凋亡 衰老 siRNA 糖尿病 內(nèi)皮功能 自噬 衰老 凋亡 benazepril losartan　出處：《浙江大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在糖尿病大血管及微血管并發(fā)癥中,內(nèi)皮細(xì)胞功能異常發(fā)揮關(guān)鍵作用。導(dǎo)致內(nèi)皮功能異常的機(jī)制是多方面的,能量代謝失衡、鈣超載、氧自由基、炎癥反應(yīng)和線粒體損傷都參與了內(nèi)皮損傷的進(jìn)展。線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣的細(xì)胞器,不僅維持細(xì)胞的基礎(chǔ)能量代謝,線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變對(duì)細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵性調(diào)控作用。近年來,線粒體依賴的自噬(線粒體自噬)成為研究的熱點(diǎn),線粒體自噬通過對(duì)損傷細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的自身消化來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及促進(jìn)細(xì)胞生存,并能通過對(duì)凋亡、壞死、衰老的調(diào)節(jié)決定細(xì)胞最終的命運(yùn)。最新的研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬在急性缺血性心血管疾病中發(fā)揮重要作用。但線粒體自噬在糖尿病血管病變中是否同樣發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用,目前尚缺乏關(guān)鍵性證據(jù)。 腎素-血管緊張素(RAS)是最常見及最重要的心臟疾病致病因子。但在血管病變中RAS的活化狀態(tài)尚存爭(zhēng)議,而對(duì)不伴心肌病變的糖尿病患者是否需要應(yīng)用RAS抑制劑目前更是缺乏直接的理論依據(jù)。臨床試驗(yàn)則證實(shí)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑具有不同程度的血管內(nèi)皮保護(hù)作用,提示RAS可能參與內(nèi)皮功能損傷的進(jìn)程。但RAS在體內(nèi)的確切致病機(jī)制目前尚不清楚,近期的研究發(fā)現(xiàn),在心肌肥厚和心衰小鼠中,線粒體氧化應(yīng)激是RAS的一個(gè)值得信賴的靶點(diǎn)。在新生大鼠心肌細(xì)胞中,RAS激活的自噬反應(yīng)是心肌細(xì)胞正常發(fā)育的必要條件�；蛟S,RAS通過線粒體誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)在糖尿病血管內(nèi)皮病變中同樣發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。 為了闡明線粒體自噬對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其與RAS的相互作用關(guān)系,本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、糖尿病大鼠及無心血管、腫瘤并發(fā)癥的糖尿病患者為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,從組織、細(xì)胞及分子水平研究RAS-線粒體對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、衰老及自噬的影響及作用機(jī)制,并對(duì)可能的調(diào)控因子進(jìn)行探討。 第一部分：高糖誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的功能研究 目的： 本研究主要探討不同葡萄糖濃度或者高葡萄糖濃度下不同作用時(shí)間對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬及凋亡的影響。 方法： 1.HUVEC在無血清ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后,加入不同濃度葡萄糖(11,16.5,22,27.5,33mM)共同作用72h,或者33mmM葡萄糖分別作用72,48,24,6h。ECM培養(yǎng)基基礎(chǔ)葡萄糖濃度5.5mM。同時(shí)給予33mM甘露醇作為對(duì)照排除滲透壓升高的影響。 2.葡萄糖處理后,分別行細(xì)胞周期、β-半乳糖苷酶染色、細(xì)胞衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集(SAHF)和衰老相關(guān)蛋白檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞衰老。 3.葡萄糖處理后,檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白及自噬啟動(dòng)蛋白的表達(dá),并分別給予AICAR、CC調(diào)控自噬啟動(dòng)蛋白AMPK,評(píng)估葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響。 4.葡萄糖處理后,流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果： 1.葡萄糖呈現(xiàn)濃度及劑量依賴性地促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老,且這種促進(jìn)與滲透壓改變無關(guān)。 2.葡萄糖誘導(dǎo)自噬標(biāo)志蛋白及自噬啟動(dòng)蛋白的高表達(dá),且獨(dú)立于滲透壓改變。抑制AMPK磷酸化反應(yīng)可以廢除高糖誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。 3.培養(yǎng)條件下,高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無明顯影響。 結(jié)論： 本研究表明,高糖可以明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬,但對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無明顯影響。且內(nèi)皮細(xì)胞損傷為滲透壓非依賴性。 第二部分：RAS-線粒體損傷在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮損傷中的作用研究 目的： 本研究探討RAS-線粒體損傷在高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮損傷中發(fā)揮的作用。 方法： 1.葡萄糖處理后,檢測(cè)ACE1、AGTR1、AGTR2mRNA和蛋白水平變化。 2.葡萄糖處理后,分別行線粒體膜電位、活性氧、NADPH、胞漿Ca2+、細(xì)胞色素C定位檢測(cè)評(píng)估線粒體功能。 3.在HUVEC中加入Ang Ⅱ(1uM)作用72h,模擬33mM葡萄糖作用72h對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體損傷、細(xì)胞衰老、細(xì)胞自噬的影響。 4.在HUVEC中分別加入Benazepril(1uM)、Losartan (10uM)作用6h后,與33mM葡萄糖共同孵育72h,檢測(cè)線粒體損傷、細(xì)胞衰老、細(xì)胞自噬。 5.應(yīng)用CCCP直接誘導(dǎo)線粒體通透孔開放,觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬及凋亡反應(yīng)。CCCP與Benazepril及Losartan共同孵育,觀察線粒體損傷、細(xì)胞凋亡、自噬及衰老反應(yīng)。 結(jié)果： 1.葡萄糖誘導(dǎo)ACE1、AGTR1mRNA和蛋白的高表達(dá),但對(duì)AGTR2的表達(dá)無明顯改變。 2.葡萄糖誘導(dǎo)線粒體膜電位降低、NADPH表達(dá)下降、活性氧表達(dá)增高、胞漿Ca2+超載、細(xì)胞色素C與線粒體解耦連。 3. Ang Ⅱ作用72h模擬高糖誘導(dǎo)的線粒體損傷,內(nèi)皮細(xì)胞衰老及自噬反應(yīng)增力口。 4. Benazepril或Losartan可以改善高糖誘導(dǎo)的線粒體損傷及內(nèi)皮細(xì)胞損傷反應(yīng)。 5.線粒體通透孔完全開放可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、自噬反應(yīng)高表達(dá)。低劑量CCCP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無影響。 6.線粒體通透孔開放完全逆轉(zhuǎn)Benazepril及Losartan對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。 結(jié)論： 本研究結(jié)果表明,葡萄糖通過ACE1、AGTR1的激活誘導(dǎo)線粒體損傷,而線粒體損傷誘發(fā)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老、自噬及凋亡反應(yīng)增強(qiáng)。 第三部分：自噬限制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老及凋亡 目的： 本研究探討細(xì)胞自噬對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老和凋亡的影響,同時(shí)進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。 方法： 1.在HUVEC中加入不同的自噬抑制劑(3-MA、CC)及自噬激動(dòng)劑(AICAR、 CCCP)后,觀察內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡變化情況。 2.對(duì)自噬小體骨架分子LC3、beclin1分別行siRNA干擾,觀察內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡。 3.3-MA分別與Benazepril及Losartan共同孵育,觀察內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡。 結(jié)果： 1.3-MA、CC加速高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡,AICAR、CCCP部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老、凋亡。 2.LC3、beclin1siRNA干擾促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老,并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 3.3-MA廢除Benazepril及Losartan誘導(dǎo)的衰老延遲,并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： 本研究表明,自噬限制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老及凋亡。 第四部分：糖尿病患者及糖尿病大鼠血管內(nèi)皮中存在自噬標(biāo)志物、衰老標(biāo)志分子聚集和衰老細(xì)胞表達(dá)增加 目的： 本研究驗(yàn)證自噬、衰老、凋亡在糖尿病患者及糖尿病大鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮中的表達(dá)情況,并觀察Benazepril及Losartan對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用。 方法： 1.腹腔注射STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,分別給予benazepril、losartan、生理鹽水每日灌胃,持續(xù)灌胃8周。 2.大鼠麻醉后,檢測(cè)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能及內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能。 3.免疫組化檢測(cè)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮中自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)。 4.ELISA檢測(cè)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮SA-β-gal表達(dá)。 5.TUNEL檢測(cè)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 6.Weastern blot檢測(cè)糖尿病患者動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬、凋亡及衰老標(biāo)志蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.糖尿病大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損,內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能無明顯改變；血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白、SA-β-gal表達(dá),TUNEL陽性細(xì)胞率上升。 2. benazepril、losartan可以改善糖尿病大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損,降低血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白、SA-β-gal表達(dá),TUNEL陽性細(xì)胞率。 3.糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬、凋亡及衰老標(biāo)志蛋白的表達(dá)量增高。 結(jié)論： 本研究表明,自噬、衰老、凋亡參與糖尿病患者及糖尿病大鼠動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,抑制RAS可以明顯改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能及減輕自噬、衰老、凋亡聚集。
[Abstract]:In diabetic macrovascular and microvascular complications, endothelial cell dysfunction plays a key role. The mechanisms leading to endothelial dysfunction is various, the imbalance of energy metabolism, calcium overload, oxygen free radicals, inflammation and injury of mitochondria are involved in the progression of endothelial injury. Mitochondria are the largest number of eukaryotic cells, organelles the most widely distributed, not only to maintain the energy metabolism of cells, changes in mitochondrial structure and function plays a key role in the regulation of apoptosis. In recent years, the mitochondria dependent autophagy (mitochondrial autophagy) has become a hot research, based on mitochondrial autophagy of damaged organelles and protein itself to maintain cell homeostasis and promote digestion cell survival, and through the regulation of apoptosis, necrosis, senescence cell determines the final fate. The latest study found that mitochondrial autophagy in acute ischemic cardiovascular disease But whether mitochondrial autophagy also plays a key regulatory role in diabetic vascular disease is still lacking key evidence.
Renin angiotensin system (RAS) is the most common and the most important factor in causing heart disease. But the activation is controversial in vascular lesions in RAS, and in diabetic patients without myocardial lesions whether to use RAS inhibitors currently is the lack of direct theoretical basis. Clinical trials showed that angiotensin converting enzyme inhibitors have the protective effect of vascular endothelial cells, suggesting that RAS may be involved in endothelial function damage process. But RAS on the exact pathogenic mechanism in vivo is unclear, a recent study showed that in myocardial hypertrophy and heart failure in mice, mitochondrial oxidative stress is a reliable target for RAS. In myocardial cells in newborn rats, autophagy activation of RAS is necessary for the normal development of myocardial cells. Perhaps, autophagy induced by mitochondrial RAS also on diabetic vascular endothelial lesions The regulatory role of key key.
In order to elucidate the protective effect of mitochondrial autophagy on high glucose induced endothelial cell injury and its interaction with RAS, in this study, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), diabetic rats and diabetic cardiovascular complications, patients with cancer as the experimental object, from the organization, on high glucose induced endothelial cell apoptosis of RAS- cells and molecules the level of mitochondria, effects and mechanism of senescence and autophagy, and regulatory factors may be discussed.
Part 1: functional study of high glucose induced injury of umbilical vein endothelial cells
Objective:
In this study, the effect of different glucose concentration or high glucose concentration on the aging, autophagy and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells was investigated.
Method錛，

本文編號(hào)：1483049