發(fā)布時(shí)間：2018-01-30 05:23

  本文關(guān)鍵詞： 脂多糖 腫瘤壞死因子-α 急性腎損傷 人參二醇組皂甙 地塞米松　出處：《吉林大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 膿毒血癥誘發(fā)的失控性全身性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）是導(dǎo)致多器官功能衰竭的重要原因，而急性腎損傷（AKI）是其中最嚴(yán)重的并發(fā)癥，致死率極高。然而，外源性糖皮質(zhì)激素能逆轉(zhuǎn)這種危機(jī)狀態(tài)，使心血管系統(tǒng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，各器官的功能恢復(fù)，從而可挽救患者生命[6]。糖皮質(zhì)激素（GC）的生物學(xué)活性由糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor，GR)介導(dǎo)，GR調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，當(dāng)GC與GR結(jié)合后可導(dǎo)致GR的活化，活化的GR入核后與正調(diào)節(jié)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（Glucocorticoid response element，GRE）結(jié)合，能夠誘導(dǎo)一些抗炎蛋白的表達(dá)，如IκB。目前認(rèn)為，GR發(fā)揮抗炎作用的主要機(jī)制是通過蛋白與蛋白之間的相互作用來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用；而GC的大多數(shù)副作用主要是由其轉(zhuǎn)錄激活作用誘導(dǎo)的。實(shí)際上，糖皮質(zhì)激素?fù)尵任０Y和多種難治性疾病的功能很強(qiáng)大。盡管如此，糖皮質(zhì)激素的副作用不容忽視,譬如，胃腸道應(yīng)激性出血可成為各種危癥患者的隱形殺手。此外，肥胖、骨質(zhì)疏松癥和胰島素抵抗等副作用難以防治[7]。因此，臨床急需有與糖皮質(zhì)激素類似療效而無糖皮質(zhì)激素樣副作用的藥物。 自古以來，人參被譽(yù)為“百草之王”。為用現(xiàn)代技術(shù)證實(shí)人參有“起死回生”的功效，本人就讀的學(xué)科通過系列研究發(fā)現(xiàn)，人參二醇組皂苷（PDS）有與地塞米松相類似地改善失血性休克犬心肺微循環(huán)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)心肺功能等作用；在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型中，PDS和地塞米松都可上調(diào)IκB的表達(dá)，轉(zhuǎn)位入核的NF-κB減少。使細(xì)胞因子的分泌明顯減少，從而有效地阻遏了免疫系統(tǒng)的活化，實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠臟器損傷的逆轉(zhuǎn)作用。特別是PDS沒有地塞米松相類似的副作用。 目的： 擬在建立LPS誘導(dǎo)急性腎損傷（AKI）小鼠模型的基礎(chǔ)上，對(duì)比研究PDS和地塞米松逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)AKI腎功能的作用與機(jī)制。揭示PDS和地塞米松相類似地改善AKI腎功能作用的分子機(jī)制，為人參二醇組皂苷開發(fā)成替代地塞米松等糖皮質(zhì)激素的藥物提供理論依據(jù)。 方法與結(jié)果： 1．成功地復(fù)制了LPS誘導(dǎo)的AKI早期動(dòng)物模型，PDS與地塞米松有類似的保護(hù)AKI小鼠腎功能的作用 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組（n=8）：鹽水對(duì)照組（Control組）、LPS模型組（LPS組）、PDS+LPS組、Dexa+LPS組，對(duì)照組經(jīng)腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.5ml，其余三組分別經(jīng)腹腔注射LPS10mg/kg。PDS+LPS組、Dexa+LPS組小鼠在LPS注射前1h分別經(jīng)腹腔注射PDS（25.0mg/kg）或地塞米松（2.5mg/kg）。 LPS處理12h后麻醉下，取腎臟、心臟、肝臟等組織凍存或固定，備蛋白表達(dá)與形態(tài)學(xué)觀察；采集血液，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）水平。 1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 LPS組小鼠血尿素氮和肌酐水平與生理鹽水對(duì)照組比較極顯著增高（P0.01）。LPS組腎臟組織切片HE染色見輕微改變。說明LPS（10mg/kg，12h）誘導(dǎo)的AKI模型成功，并屬于AKI的早期階段。LPS組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）含量與對(duì)照組比較明顯增高（P0.01），顯示LPS組已發(fā)生心臟和肝臟細(xì)胞的明顯損傷，證明LPS誘導(dǎo)了全身炎癥反應(yīng)綜合征。血尿素氮和肌酐含量，PDS+LPS組和Dexa+LPS組與LPS組比較均明顯降低（P0.05），說明PDS有與地塞米松相類似地保護(hù)腎功能的作用。 2. PDS和地塞米松有類似的逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)AKI腎功能的機(jī)制 2.1PDS和地塞米松影響LPS誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 應(yīng)用免疫組化及免疫印跡法檢測(cè)不同組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示LPS組凋亡蛋白Bax、Cleave-caspase3、Cyto C表達(dá)增多，而PDS+LPS組及Dexa+LPS組較LPS組表達(dá)減少；抗凋亡蛋白Bcl-2在LPS組表達(dá)減少，而PDS+LPS組及Dexa+LPS組較LPS組表達(dá)增多。提示注射LPS（10mg/kg）12小時(shí)后小鼠腎臟細(xì)胞發(fā)生凋亡，而PDS+LPS組及Dexa+LPS組凋亡程度較LPS組減輕�？梢�，PDS及地塞米松影響凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，減少LPS誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡。 2.2PDS和地塞米松抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少AKI小鼠細(xì)胞因子的產(chǎn)生與釋放 2.2.1應(yīng)用免疫印跡的方法檢測(cè)IκB和NF-κB p65、p50的蛋白表達(dá) 結(jié)果表明LPS組IκB的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較明顯降低（P0.05），PDS+LPS組IκB蛋白表達(dá)水平明顯高于LPS組（P0.05），Dexa+LPS組的IκB表達(dá)水平與LPS組比較也有增加趨勢(shì)。LPS組的核NF-κB P65和P50的表達(dá)水平與對(duì)照組比較顯著增高（P0.05）。然而，與LPS組比較，PDS+LPS組和Dexa+LPS組的核NF-κB P50表達(dá)水平顯著下調(diào)（P0.05），NF-κB P65表達(dá)水平有下降趨勢(shì)�？梢�，，PDS和地塞米松抑制了NF-κB信號(hào)通路的活化。 2.2.2應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中TNF-α和IL-6含量 結(jié)果顯示，LPS組TNF-α和IL-6含量與對(duì)照組比較顯著增高（P0.01）。然而，PDS+LPS組的TNF-α和IL-6含量與LPS組比較均明顯降低（P0.05），Dexa+LPS組與LPS組比較TNF-α有下降趨勢(shì)，IL-6顯著降低（P0.05）。這是PDS和地塞米松抑制了NF-κB信號(hào)通路的結(jié)果。 2.3PDS和地塞米松有抑制腎臟組織氮氧自由基產(chǎn)生和上調(diào)SOD活性的作用 LPS組iNOS蛋白表達(dá)水平和NO含量與對(duì)照組比較均顯著增高（P0.05）。然而，PDS+LPS組和Dexa+LPS組的iNOS蛋白表達(dá)水平和NO含量均顯著地低于LPS組（P0.05）。 LPS組MDA含量與對(duì)照組比較明顯增高（P0.05），而清除氧自由基的酶SOD含量和Mn-SOD的蛋白表達(dá)水平明顯下降（P0.05）。LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激加重AKI小鼠的腎臟功能障礙。然而，PDS和地塞米松則通過抗氧化應(yīng)激作用保護(hù)LPS誘導(dǎo)的AKI腎臟功能。 3．PDS與地塞米松有類似地增加細(xì)胞核GR表達(dá)的作用，可能是GR的功能配體 3.1PDS明顯增加了細(xì)胞核GR的表達(dá) 應(yīng)用免疫印跡的方法檢測(cè)GR的表達(dá)。結(jié)果表明總的GR（t-GR）除對(duì)照組表達(dá)最低，其余3組t-GR表達(dá)水平均明顯增高，組間沒有差異。LPS組核GR（n-GR）的表達(dá)水平在各組中最低，以PDS+LPS組的n-GR表達(dá)水平為最高，Dexa+LPS組次之。故推測(cè)，對(duì)于GR來說，PDS有地塞米松樣的GR配體作用。 3.2PDS可能是糖皮質(zhì)激素受體的功能配體，并呈劑量依賴性增加GR的轉(zhuǎn)錄活性 在含有糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件的熒光素酶報(bào)告基因（GRE-Luciferase）與GR共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中熒光強(qiáng)度很低。當(dāng)加入地塞米松100μmol/L時(shí)，GR的轉(zhuǎn)錄活性增加36.5倍。在用不同劑量PDS取代地塞米松時(shí)，GR的轉(zhuǎn)錄活性如下：①加入25μg/mlPDS時(shí)，對(duì)GR的轉(zhuǎn)錄活性沒有影響；②加入PDS為50μg/ml時(shí)GR的轉(zhuǎn)錄活性增加5.5倍；③當(dāng)加入PDS為100μg/ml時(shí)，GR的轉(zhuǎn)錄活性增至12倍�？梢�，PDS有與地塞米松樣和GR結(jié)合作用，并呈劑量依賴性增加GR的轉(zhuǎn)錄活性。因此，我們推測(cè)PDS可能是GR的功能配體。 結(jié)論： 1．人參二醇組皂苷有與地塞米松相類似地逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的小鼠AKI作用。而且，這種逆轉(zhuǎn)作用是通過相同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。 2．人參二醇組皂苷可能是GR功能性配體的依據(jù)：PDS和地塞米松有同樣的增強(qiáng)細(xì)胞核糖皮質(zhì)激素受體（GR）表達(dá)的作用；在含有糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件的熒光素酶報(bào)告基因（GRE-Luciferase）與GR共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞反應(yīng)體系中，PDS有與地塞米松相似的與GR結(jié)合作用，并且，PDS呈劑量依賴性增加GR的轉(zhuǎn)錄活性，故推測(cè)PDS可能是GR的功能配體，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。 3.人參二醇組皂苷具有潛在臨床應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1475402