本文關鍵詞： 骨性關節(jié)炎 軟骨下關 關節(jié)軟骨 血管形成 常山酮　出處：《南方醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、研究背景骨性關節(jié)炎是最常見的多因素引起的關節(jié)退行性疾病,以進行性的關節(jié)軟骨損傷、軟骨下骨硬化和關節(jié)周圍骨贅形成為特征。關節(jié)疼痛是患者主要的臨床表現(xiàn)。目前臨床上對骨性關節(jié)炎的治療沒有特別有效的方法,主要以緩解患者癥狀及關節(jié)功能從而有限的改善患者生活質量為目標。關節(jié)置換是骨性關節(jié)炎晚期患者必需面臨的選擇。但是關節(jié)置換手術創(chuàng)傷大,花費高,同時也伴隨著手術失敗及后續(xù)翻修的風險。骨性關節(jié)炎已經(jīng)為社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔,同時在中國正逐步步入老齡化的今天,這種經(jīng)濟及社會負擔將會進一步增加。目前找到一種有效的預防或治療骨性關節(jié)炎的方法是迫切需要的。近期國內(nèi)外研究團隊在骨性關節(jié)炎發(fā)病機制方面所取得的進展為骨性關節(jié)炎的治療提供了新的視點。越來越多的基礎和臨床研究支持骨性關節(jié)炎不僅僅是軟骨病患,而是整個關節(jié)包括軟骨和軟骨下骨整體的疾病。軟骨下骨為軟骨提供力學支持,同時軟骨下骨自身不斷進行著動態(tài)的適度的重塑去適應周圍微環(huán)境的變化。近期研究表明,在骨性關節(jié)炎發(fā)病進程中,軟骨下骨在異常的力學刺激下骨吸收異常增加,在軟骨下骨可見異常增多的TRAP細胞。增強的骨吸收激活釋放過量的埋藏在骨基質中的陰性轉化生長因子TGF-β,進而誘導異常的、骨吸收和骨形成未偶聯(lián)的重塑：過量激活的轉化生長因子TGF-β將骨髓間充質干細胞(MSCs)動員誘導至骨髓腔形成異位“骨島”,而不能到達骨吸收部位去形成新骨以偶聯(lián)骨吸收,從而改變了軟骨下骨對關節(jié)軟骨的應力刺激,最終引起關節(jié)軟骨的破壞而誘發(fā)骨性關節(jié)炎的發(fā)生。目前對于骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制的有幾點共識：異常的力學刺激在骨性關節(jié)炎發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用,這種異常的力學刺激將誘導軟骨下骨進行異常的未偶聯(lián)的骨重塑；骨性關節(jié)炎不僅僅是關節(jié)軟骨疾病,軟骨下骨與關節(jié)軟骨是一對功能共同體,在骨性關節(jié)炎發(fā)病過程中相互協(xié)調(diào)、相互影響；骨性關節(jié)炎的發(fā)病是一個動態(tài)的、軟骨下骨和關節(jié)軟骨相互影響的以及是不斷累積的過程。常山酮是從一種植物常山里所提取出來的物質。常山酮作為中藥的成分被用來治療瘧疾在中國已有兩千多年的歷史。近期研究表明,常山酮可以被用來治療纖維化的疾病,通知抑制轉化生長因子TGF-β通路的smad2/3磷酸化；同時常山酮可以用來抑制Th17細胞的分化,而近年來研究表明Th17細胞可以分泌IL1 7誘導促進破骨細胞的分化從而增強骨吸收；血管形成也被認為是骨性關節(jié)炎發(fā)病的一個重要原因,亦有報道表明常山酮可以從多個階段來抑制血管的形成。本研究旨在通過研究常山酮對轉化生長因子TGF-β通路、Th17細胞分化以及血管形成方面的作用來探討闡述骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制,為骨性關節(jié)炎的預防和臨床治療提供一個新的視點和理論基礎。二、研究方法(一)常山酮對骨性關節(jié)炎軟骨下骨及關節(jié)軟骨的影響1,動物模型的建立我們從Charles River購買了3個月大小的雄性的C57BL/6J (WT)小鼠和Lewis大鼠。鼠被分為三組：對照組、實驗組給予常山酮及實驗組給予安慰劑PBS。小鼠藥物注射為腹腔內(nèi)注射,劑量為1mg/kg,隔天一次,注射一個月。大鼠予以局部包埋藥物。鼠在麻醉的狀態(tài)下予以做前交叉韌帶切斷術(ACLT)以建立骨性關節(jié)炎模型。麻醉方法：購買的麻醉藥有20mg/ml的Xylazine(甲苯噻嗪)及100mg/ml的Ketamine(克他命)。將20mg/ml的Xylazine(甲苯噻嗪)稀釋至2mg/ml。我們用需要配制麻藥的總體積數(shù)除以8.3以獲得2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的體積數(shù),再用總體積減去2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的體積數(shù)即為100mg/ml的Ketamine(克他命)的量。比如我們配制總體積數(shù)5m1的量,2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)的體積為5/8.3=0.6m1,則100mg/ml的Ketamine(克他命)的量為5-0.6=4.4m1。將0.6m1的2mg/mlXylazine(甲苯噻嗪)與4.4 ml的100mg/ml的Ketamine(克他命)混合即為我們需要的麻醉劑。每只老鼠的用量(20-26克)約為100-120微升。老鼠麻醉后,將老鼠固定在顯微鏡的平臺上,將老鼠將要做手術的腿固定屈曲90度以便于切斷前交叉韌帶。實驗技巧：剪毛,只用酒精浸濕的紗布擦濕毛發(fā)即可,不要用噴霧器去噴,黏貼膠布打濕后很難再次黏住,給手術帶來很多不必要的困惑；打開膝上皮膚,用鑷子鈍性分離皮下筋膜,避開皮下血管。從股內(nèi)側肌形成髕韌帶的連接處剪開股內(nèi)側肌,注意避開股內(nèi)側肌肌肉內(nèi)的血管,避免出血。此時的難點在于將髕骨推至外側以暴露膝關節(jié)間隙。手術技巧在于用剪刀進一步剪開骨外膜,將骨外膜剪開后,即可輕易將髕骨推開。若不剪開骨外膜,即使花費很多時間處理髕骨下組織,也很難將髕骨推開同時會導致出血。暴露膝關節(jié)間隙后,用顯微鑷子拉開髕骨下脂肪墊,剪斷前交叉韌帶即可。后縫合傷口,碘酒外涂抹。手術做完后注意鼠的復蘇,一般在鼠手術后將鼠放在40度左右的小電熱毯上,大概在術后10-30分鐘后鼠將復蘇。此時,將鼠放回動物房,前交叉韌帶切除(ACLT)模型建立成功。2,關節(jié)軟骨各項指標的檢測首先我們通過HE和Safranin O and fast green染色來判斷關節(jié)軟骨大體的情況。關節(jié)從軟骨至骨基本結構是：透明軟骨、鈣化軟骨、軟骨下骨生長版、軟骨下骨、生長板及骨質結構。透明軟骨與鈣化軟骨之間有一條tidemark線。以此tidemark線的上移與否可以判斷關節(jié)軟骨鈣化的情況。Safranin 0染色可以把關節(jié)軟骨染為紅色,骨為綠色。在骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中,關節(jié)軟骨退行性病變,會致使關節(jié)軟骨糖蛋白丟失,使軟骨著色變淺或者引起軟骨下骨的浸潤,有綠色骨組織出現(xiàn)。繼而我們通過免疫染色去檢測軟骨分子蛋白的變化來進一步驗證軟骨的變化情況。我們選用的指標是Lubricin,(基質金屬蛋白酶)MMP13及(膠原酶)Col X. Lubricin分布關節(jié)軟骨的表明。大量實驗證明,很多關節(jié)組織都分泌Lubricin,包括關節(jié)軟骨細胞、滑膜細胞、半月板細胞以及交叉韌帶細胞等。Lubricin主要作用為潤滑膝關節(jié),減少膝關節(jié)的摩擦力及滑膜等組織對軟骨的浸潤。在OA的進展過程中,Lubricin的表達量將會降低。關節(jié)軟骨是有軟骨細胞、Ⅱ型膠原分纖維及糖蛋白等物質組成。糖蛋白功能似“海綿”以吸收和釋放關節(jié)周圍的水分來適應關節(jié)力學的變化。Ⅱ型膠原纖維構成關節(jié)軟骨的骨架蛋白。正常狀態(tài)下,膝關節(jié)承受著正常的生理狀態(tài)下的力學刺激,關節(jié)軟骨進行正常的應力刺激去分泌Lubricin、Ⅱ型膠原纖維及糖蛋白去維持關節(jié)軟骨的內(nèi)穩(wěn)定。然而當在創(chuàng)傷等條件下,膝關節(jié)將承受異常的力學刺激,關節(jié)軟骨在異常的力學刺激將會發(fā)生復雜的分子生物學的變化,將會減少Lubricin及糖蛋白等的分泌。同時增加MMP13及Col X的分泌。MMP13主要裂解Ⅱ型膠原纖維以破壞關節(jié)軟骨的結構。Col X是關節(jié)軟骨肥大的指標,也是軟骨破壞的指標。最后我們用Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-modified Mankin scores來對關節(jié)軟骨的破壞程度給以量化評價。在評價量表中,總分等于等級乘以階段(score=grade x stage)。等級共分為6個等級,第一個等級是關節(jié)表面是完整的(surface intact):在軟骨表層可能伴隨細胞的增生和壞死,但是軟骨中下層沒有波及到；第二個等級是表層不連續(xù)(surface discontinuity):表層軟骨伴灶性原纖維形成,并可能延伸至中層軟骨,在中層軟骨里可能伴有細胞的增生和死亡；第三個等級是垂直裂紋從軟骨表層延伸至中層(vertical fissures extending to mid-zone):同時侵入到中層的原纖維更多,并可能伴有裂紋延伸至軟骨底層；第四個等級是侵蝕(erosion):可以觀察到關節(jié)軟骨基質的丟失,基質丟失的主要區(qū)域正在裂紋附近；第五個等級是裸露(denudation):鈣化的軟骨或軟骨下骨直接暴露出來,微骨折見空隙可能被修復性的纖維軟骨所占據(jù)；第六個等級是變形(deformation):較多的微骨折及修復性的纖維軟骨,改變了整個關節(jié)軟骨的輪廓。同時將OA的進程分為四個階段。每個階段意味著被破壞的關節(jié)面占整個關節(jié)面的比例,與OA的等級無關。第一個階段表明受損的軟骨占總軟骨表明的10%；第二個階段表明約占10%-25%；第三個階段為25%-50%；第四個等級表明軟骨表面損傷的面積超過總軟骨表面的50%。我們以等級與階段的乘積作為每個標本的最終評分。3,軟骨下骨各項指標的檢測首先我們使用三維micro-CT掃描骨組織結構來測骨微觀結構的變化情況。我們將老鼠吸入麻醉安樂死(Forane),去鼠膝關節(jié)包括股骨下段和脛骨上段。后用10%福爾馬林固定膝關節(jié)24小時(10% buffered formalin phosphate),后將10%福爾馬林更換為1x PBS。標本使用高分辨率的三維CT掃描機掃描(SkyScan 1172),掃描后用三維CT重建軟件對標本進行三維重建(NRecon v1.6),并使用分析軟件對重建的三維CT掃描重建數(shù)據(jù)進行分析(CTAn v1.9 and CTVol v2.0)。我們將對軟骨下骨的下列指標進行分析：總組織體積包括松質骨和皮質骨(TV);骨體積在同體積中所占有的量(BV/TV);松質骨厚度(Tb.Th),松質骨數(shù)量(Tb.N),松質骨分離度(Tb.Sp),連接密度(connectivity density),軟骨下骨板厚度(SBP.Th)以及松質骨模式因子(trabecular pattern factor)。同時我們也對軟骨下骨的骨重塑進行檢測。我們用免疫染色的方法染色軟骨下骨TRAP及Osterix的變化情況。TRAP主要反映軟骨下骨破骨細胞變化情況,即骨吸收；Osterix是成骨細胞的標記mark,反映的是軟骨下骨的骨形成。當我們將鼠膝關節(jié)前交叉韌帶離斷(ACLT)后,鼠膝關節(jié)將承受異常的力學刺激。增強的力學刺激會影響軟骨下骨的骨重塑(bone remodeling),從而影響軟骨下骨骨吸收(bone resorption)及骨形成(bone formation)的變化。(二)常山酮對骨性關節(jié)炎早期軟骨下骨Th17細胞的影響1,檢測Th17細胞在軟骨下骨的變化情況我們首先通過免疫染色來確定軟骨下骨Th17細胞的變化。Th17屬于CD4+的免疫T細胞,其分泌IL17來發(fā)揮作用。實驗中常采用CD4+IL17+雙染陽性細胞來定義Th17細胞。我們認為在骨性關節(jié)炎發(fā)展的早期,即在鼠的前交叉韌帶被切斷的早期,膝關節(jié)因承受異常的力學刺激,而引起局部炎癥反應。T細胞會滲透至軟骨下骨內(nèi)。滲透過來的T細胞會在軟骨下骨微環(huán)境下分化為Th17細胞,因為股重塑過程中會釋放出骨基質中的轉化生長因子TGF-p,而轉化生長因子TGF-P是Th17細胞分化的必須物質。鼠膝關節(jié)標本被三維CT掃描以后,放于脫鈣液中3-4周進行脫鈣(10% EDTA)。后石蠟包(paraffin)或者冰凍包埋(OTX:optional cutting temperature)。組織切片時切片厚度為4微米。同時我們使用流式細胞(flow cytometry)進一步驗證Th17細胞的變化。我們?nèi)ダ鲜蟮墓撬韬屯庵苎�。老鼠給予吸入麻醉(forane),外周血采用心臟抽血的方法,每只鼠約600-1000微升。取骨髓通過將長骨兩端剪開,使用注射器沖洗。后將骨髓及外周血按相應處理進行流式細胞分析。除此之外,我們進一步做了術后不同時間段Th17含量的變化。我們?nèi)⌒g后2周和1個月作為時間點去驗證Th17的變化是否隨時間的變化而變化。2,檢測軟骨下骨RANKL量的變化我們采用免疫熒光染色的方法去定量軟骨下骨RANKL含量。RANKL是破骨細胞分化的必須物質。在軟骨下骨的微環(huán)境中,Th17將分泌IL17因子作用于軟骨下骨的成骨細胞上,成骨細胞將分泌RANKL作用于破骨細胞前體細胞而促進破骨細胞的形成而促進骨吸收。即為軟骨下骨在異常應力刺激下進行異常骨重塑的先決條件。(三)常山酮對軟骨下骨MSCs細胞TGF-β介導的smad2/3信號通路的影響1,體外培養(yǎng)MSCs, Western Blot觀察常山酮對TGF-β通路的影響我們從Texas AM Health Science Center College of Medicine Institute獲得GFP標記的成年鼠骨髓間充質干細胞MSCs。細胞傳至3-5代獲得我們所需要的細胞量一部分進行試驗一部分液氮凍存。培養(yǎng)基為Iscove's modified Dulbecco's medium (Invitrogen),輔以10% FCS (Atlanta Biologicals)、10%馬血清(Thermo Scientific)以及1%青霉素-鏈霉素溶液(Mediatech)。細胞被培養(yǎng)在6孔板上,細胞的密度為1.8×105/每孔。待細胞長滿培養(yǎng)皿后,提前予以添加常山酮(sc-211579, Santa Cruz Biotechnology)預處理4小時、8小時及12小時。于添加轉化生長因子TGF-β (RD Systems)前,饑餓細胞4小時。轉化生長因子TGF-β與細胞作用30分鐘。后提取蛋白,每孔加200微升的細胞裂解液和蛋白酶抑制劑的混合溶液。所有操作在冰上進行。提取完蛋白后,將放于蛋白的試管放于冰中1小時,每10分鐘震蕩一次。后離心,13.2×103rpm,4度,10分鐘。將離心后的蛋白定量。后取適度的蛋白的與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)混合,100度水浴5-10分鐘。蛋白電泳跑膠,首先配膠。10%下層膠(2塊)：5.99毫升dd H2O、3.8ml PH8.8的下層膠緩沖液、5.01ml 30%ACR、224微升10% APS及10微升TEMED.8%上層膠(2塊)：4毫升dd H2O、1.77ml PH6.8的下層膠緩沖液、1.2ml 30% ACR、112微升10%APS及10微升TEMED.將蛋白加樣,60伏2-3小時。后將蛋白轉膜至PVDF膜。后洗3遍,5分鐘每次,5%milk封閉1小時,加入一抗4度過夜。第二天,取出放在室溫下20-30分鐘,回收一抗。有洗液洗6遍,10分鐘每次。加入二抗室溫下1小時,后洗6遍,10分鐘每次。后暗室內(nèi)顯色獲得實驗結果。2,動物體內(nèi)實驗免疫染色MSCs和磷酸化的smad2/3我們應用免疫組化及免疫熒光的方法在動物體內(nèi)進一步驗證常山酮對軟骨下骨轉化生長因子TGF-β信號通路的影響。轉化生長因子TGF-β信號通路的機制是細胞外的轉化生長因子TGF-β配體與細胞膜上的轉化生長因子TGF-β受體Ⅱ結合,后轉化生長因子TGF-β受體Ⅱ將動員招募轉化生長因子TGF-β受體Ⅰ,從而形成轉化生長因子TGF-β受體復合物。受體復合物繼而誘導smad2/3磷酸化,磷酸化的smad2/3將于smad4結合形成復合物進而轉至核內(nèi),轉至核內(nèi)的smad2/3和smad4的復合物將于相應基因結合,促進或抑制相應基因的轉錄和翻譯,從而發(fā)揮其作用。免疫組化染色psmad2/3。實驗分組動物被執(zhí)行安樂死后,我們?nèi)∈笫中g組及對照組的膝關節(jié)包括股骨下段和脛骨上段。先將膝關節(jié)固定24小時,三維CT掃描后更換為脫鈣液(10% EDTA)脫鈣3-4周。后將組織石蠟包埋,切片。切片厚度為4微米。切好的片子放于56度半小時,后保存于4度。染片時,前一天將片放于65度過夜。第二天,取出放于室溫20-30分鐘。依次過zylene3遍、100%酒精2遍、95%酒精及80%酒精。標本TBST洗3遍,5分鐘每次。同時配制1x抗原修復液預熱于65度,將標本加入65度1x抗原修復液20分鐘,后轉至99.9度20分鐘,后室溫20分鐘。倒掉抗原修復液,TBST洗3遍,5分鐘每次。封閉筆花圈,加0.6%過氧化氫(H202)封閉10分鐘。TBST沖洗,5分鐘后再次沖洗放5分鐘。后加3%BSA封閉1小時。配制一抗,加一抗4度過夜。第二天,拿出標本室溫下放置20分鐘。TBST洗滌3次,15分鐘每次。加入二抗,室溫放置1小時。TBST洗三次,每次15分鐘。DAB顯色,注意把握時間。復染細胞核(Hemotoxylin)約5-8秒。龍頭水沖洗一次。醋酸(acetic acid)5秒,后氨水(ammonia water)約1分鐘。一次過95%酒精、100%酒精兩次及xylene3次。封片,照片采集。4度保存。(四)常山酮對軟骨下骨異常血管形成的影響1,血管造影我們采用基于三維CT的血管造影來檢測在骨性關節(jié)炎發(fā)病過程軟骨下骨血管的變化情況。方法是當給予鼠安樂死后,打開胸腔找到有心室用針尖扎個孔,或用剪刀剪破。后從左心室進針沖洗整個體循環(huán)。首先給予20m1100u/ml的肝素(heparin)沖洗,預防并避免體循環(huán)內(nèi)凝血。后給予20m1的10%的福爾馬林(10% buffered formalin phosphate)固定。再以一定配比給予造影劑,可見肝臟明顯變黃。造影劑盡量每次只配一只老鼠的量,因其容易凝固而致浪費。后將老鼠放置4度1到2天,然后解剖得到膝關節(jié)標本,并放于福爾馬林里固定24小時。放于脫鈣液中脫鈣(10% EDTA)3-4周。三維CT掃描,獲得血管造影CT圖片。后用CT分析軟件分析所得到的數(shù)據(jù)(CTAn v1.9 and CTVol v2.0).2,免疫熒光染色CD31及Endomucin驗證軟骨下骨血管情況我們通過使用免疫熒光染色進一步驗證軟骨下骨血管形成情況。我們使用免疫熒光雙染CD31及Enmucin來確定H型血管(CD31+ Endomucin+)的變化。H型血管(CD31+ Endomucin+)是一種特殊類型的血管,他只出現(xiàn)在骨系統(tǒng)中,在其他系統(tǒng)或組織中陰性。同時在骨系統(tǒng)中,H型CD31+ Endomucin+血管只出現(xiàn)在骨形成時期,即此血管主要作用是偶聯(lián)血管形成和骨的形成。血管形成可以為骨的形成提供所必須的MSCs和EPCs,同時也為骨提供氧氣和營養(yǎng)物質以及排除細胞代謝所產(chǎn)生的廢物和垃圾。免疫熒光染色方法是將老鼠安樂死后,取膝關節(jié)標本包括股骨下段和脛骨上段。同時將標本固定24小時后,脫鈣3-4個星期。后冰凍包埋(OTX:optional cutting temperature),-80度保存。冰凍切片時標本厚度為0.4微米。后將標本放于室溫1-2小時。染色時不用像免疫組化那樣將標本提前放56度過夜。冰凍染色只需當天拿出標本放于室溫1小時：室溫20分鐘,40度20分鐘,后室溫再20分鐘。后用TBST洗3次。抗原修復液修復：現(xiàn)將抗原修復液預熱至65度,后將標本放于65度抗原修復液中20分鐘,后99度20分鐘。放置室溫下20-30分鐘。將修復液倒掉,TBST洗3遍,5分鐘每次。放于濕盒內(nèi),吸干花圈。加入3%BSA封閉1個小時。后加入一抗4度過夜。第二天,取出標本,放于室溫下20-30分鐘。TBST洗3次,15分鐘每次。加入二抗,室溫下放置1小時。注意此是熒光染色,加入二抗后一定要注意避光,蓋上一層錫紙放于室溫搖床上1小時。后TBST洗3遍,每遍15分鐘。因此是免疫雙染,因同時加入兩個一抗是容易相互發(fā)生反應,使結果不準確,我們多采取分次加入一抗。此時,洗過后,再次用3% BSA封閉1小時,加入第二個一抗1小時,4度過夜。第二天取出步驟同上,再次加入第二個二抗,同樣避光放于室溫1小時。后TBST洗3遍,15分鐘每次。最后DAPI封片,顯微鏡下采集照片。定量計數(shù)。分析數(shù)據(jù)。三、實驗結果1,常山酮對骨性關節(jié)炎軟骨下骨及關節(jié)軟骨的影響我們發(fā)現(xiàn)常山酮緩解了關節(jié)軟骨的破壞。HE染色顯示在非常山酮治療組中關節(jié)軟骨的tidemark線上移,而常山酮治療抑制了這一現(xiàn)象。Tidemark線將關節(jié)軟骨分割為上方的透明軟骨和下方的鈣化軟骨。Tidemark線的上移表明鈣化軟骨的增多,意味著關節(jié)軟骨的破壞增加。常山酮抑制了Tidemark線的上移,意味著常山酮保護了關節(jié)軟骨。Safranin O染色進一步表明常山酮治療緩解了關節(jié)軟骨表面糖蛋白的降解。Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-modified Mankin scores在三組動物中有顯著差異(F=136.360,P0.001)。與安慰劑治療組相比,常山酮組老鼠的OARSI分值顯著降低(P0.001)。我們進一步通過免疫染色,骨性關節(jié)炎發(fā)病過程中,Lubricin, MMP-13及Col X等分子的表達發(fā)生改變,lubricin表達在三組動物中有顯著差異(F=49.603,P0.001),其中骨性關節(jié)炎組較對照組顯著降低,降低意味關節(jié)間的摩擦力增加,關節(jié)破壞增加；MMP-13和CoL X的表達在三組間均有顯著性差異(F=26.361, P0.001; F=109.328, P0.001),而與對照組相比,骨性關節(jié)炎組MMP-13和Col X的表達增加,MMP-13可以降解關節(jié)軟骨中的Ⅱ型膠原纖維,而Col X表明關節(jié)軟骨細胞的肥大,都表明軟骨的破壞增加。我們前期臨床結果已表明,在骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中,軟骨下骨過度的骨吸收釋放激活的過多的轉化生長因子TGF-β。過多的轉化生長因子TGF-β打破了原來軟骨下骨中正常的轉化生長因子TGF-β濃度梯度,從而將骨髓間充質干細胞MSCs動員誘導至骨髓腔形成異位骨島,而非將骨髓間充質干細胞誘導至骨吸收部位以偶聯(lián)骨吸收,最終誘導關節(jié)力學環(huán)境的環(huán)境的改變,誘導了關節(jié)軟骨的破壞并最終發(fā)展成骨性關節(jié)炎。因此我們假設如果抑制了軟骨下骨轉化生長因子TGF-β的信號通路,將骨髓間充質干細胞MSCs重新誘導至骨吸收表面以偶聯(lián)骨吸收,將會緩解骨性關節(jié)炎的發(fā)生。因此我們選擇了常山酮。常山酮以抑制轉化生長因子TGF-β信號通路被臨床用于治療纖維化等疾病。與以前結果相吻合,我們發(fā)現(xiàn)老鼠前交叉韌帶(ACLT)被離斷后,軟骨下骨的骨微觀結構發(fā)生改變,三維CT掃描表明,安慰劑治療組中鼠膝關節(jié)軟骨下骨的總組織量(TV)增加,軟骨下骨松質骨模型因子(Tb.pf)增加,同時軟骨下骨板的厚度(SBP)減少,這些都表明軟骨下骨正常的骨重塑遭到破壞。我們通過進一步的免疫染色驗證軟骨下骨骨重塑的情況。TRAP染色表明安慰劑治療組軟骨下骨破骨細胞增多,意味著軟骨下骨的骨吸收增加。而常山酮抑制了軟骨下骨破骨細胞數(shù)量的增加。Osterix染色與TRAP染色一致,安慰劑治療組Osterix陽性細胞數(shù)量明顯增加,且增加的Osterix陽性細胞聚在軟骨下骨骨髓腔,而并沒有被招募到骨吸收部位去偶聯(lián)骨吸收。常山酮治療抑制了軟骨下骨Osterix陽性細胞的增加,同時Osterix陽性細胞位于骨吸收部位去偶聯(lián)骨吸收。所有數(shù)據(jù)表明常山酮通過調(diào)節(jié)軟骨下骨骨重塑保護了關節(jié)軟骨不受破壞并最終抑制了骨性關節(jié)的發(fā)生。2,常山酮對骨性關節(jié)炎早期軟骨下骨Th17細胞的影響Th17細胞可以通過分泌IL17來調(diào)控RANKL的分泌,來調(diào)節(jié)破骨細胞的成熟和分化。在本實驗模型情況下,骨性關節(jié)炎發(fā)病早期,由于前交叉韌帶被切斷導致關節(jié)不穩(wěn),關節(jié)不穩(wěn)則引起關節(jié)應力發(fā)生改變而導致異常應力刺激。而引起關節(jié)的局部炎癥反應,如炎癥細胞的滲出,包括CD4陽性的T細胞。同時由于軟骨下骨在骨重塑的情況下,會釋放活化的轉化生長因子TGF-β以偶聯(lián)骨形成和骨吸收。同時,轉化生長因子TGF-β也是CD4+T細胞分化為Th17細胞的必要條件。因此,軟骨下骨的轉化生長因子TGF-β為滲出的CD4+T細胞分化為Th17細胞的提供的了完美的環(huán)境。Th17細胞分化完成后,Th17細胞可以分泌IL17因子。IL-17主要作用于骨髓基質細胞或成骨前體細胞,促進骨髓基質細胞或成骨前體細胞分泌RANKL。RANKL則會作用于破骨前體細胞,促進破骨前體細胞的成熟并最終分化破骨細胞去吸收骨質。通過免疫熒光染色我們發(fā)現(xiàn),在前交叉韌帶離斷(ACLT)模型下,安慰劑治療組的軟骨下骨Th17的數(shù)量在術后2周顯著增高。而常山酮抑制了Th17的細胞的增多。我們進一步確認Th17細胞數(shù)量的升高是不是有時間依賴性。我們發(fā)現(xiàn),Th17細胞的數(shù)量到達峰值后(2周),會隨著時間的繼續(xù)推移而數(shù)量下降。數(shù)據(jù)顯示在術后1個月,Th17細胞的數(shù)量回到正常的水平。同時我們采用流式細胞(flo wcytometry)的方法進一步確認在骨性關節(jié)炎發(fā)病早期Th17細胞的變化情況。我們分別取鼠的骨髓和外周血。流式細胞結果與免疫熒光結果相似,我們發(fā)現(xiàn)在術后2周Th17細胞在骨髓中中顯著升高,這種增多同樣具有時間依賴性,在術后1個月時,Th17細胞的數(shù)量又回到對照組的水平。但是,Th17細胞在外周血中的含量,無論是術后2周還是術后1個月,均沒有發(fā)生顯著性差異。同時我們應用免疫熒光的方法定量RANKL在軟骨下骨的表達。如前所述,Th17細胞是通過分泌IL17因子作用于骨髓基質細胞或成骨前體細胞,以促進骨髓基質細胞或成骨前體細胞來分泌RANKL來最終促進破骨細胞的成熟及骨吸收。因此我們免疫熒光染色RANKL去驗證是否軟骨下骨Th17伴隨著RANKL含量的增加。我們發(fā)現(xiàn),安慰劑治療組軟骨下骨RANKL的表達膠對照組顯著增加,同時常山酮的抑制了RANKL的表達。這些數(shù)據(jù)進一步說明,常山酮可以抑制軟骨下骨的骨吸收通過抑制Th17的分化及其所誘導的RANKL配體含量的表達。3,常山酮對軟骨下骨MSCs細胞TGF-β介導的smad2/3信號通路的影響骨性關節(jié)炎的發(fā)生,是基于關節(jié)受到異常的力學刺激,引起關節(jié)軟骨釋放激活過多的轉化生長因子TGF-β,過多轉化生長因子TGF-β破壞了原來關節(jié)內(nèi)的溶度梯度,從而將骨髓間充質干細胞MSCs誘導至骨髓腔形成異位骨島從而誘導骨性關節(jié)炎的發(fā)生。正常受力情況下,關節(jié)軟骨下骨進行著正常的骨重塑,即破骨細胞吸收骨質,同時激活釋放儲存在骨基質中的轉化生長因子TGF-β,轉化生長因子TGF-β作用于骨髓間充質干細胞(MSCs),激活smad2/3通路TGF-β通路,從而將作用于骨髓間充質干細胞(MSCs)誘導至骨吸收表面,以偶聯(lián)骨吸收和骨形成。然而在鼠膝關節(jié)前交叉韌帶被切斷的情況下,關節(jié)承受著異常的力學刺激,導致過多的骨吸收同時釋放過多的轉化生長因子TGF-p,因此激活了過多的MSCs的smad2/3通路。使骨髓間充質干細胞MSCs在骨髓腔內(nèi)被原位激活,從而誘導了異位骨島在軟骨下骨的形成。我們?nèi)旧l(fā)現(xiàn),骨髓間充質干細胞MSCs在安慰劑治療組鼠軟骨下骨內(nèi)顯著增加,且增加的骨髓間充質干細胞MSCs位于軟骨下骨骨髓腔內(nèi),而不是位于骨吸收部位去偶聯(lián)骨吸收和骨形成。同時,常山酮抑制了骨髓間充質干細胞MSCs的數(shù)目的增加,并且將骨髓間充質干細胞MSCs重新誘導至骨吸收表面去偶聯(lián)骨形成。為了進一步去驗證轉化生長因子TGF-β是直接作用于骨髓間充質干細胞MSCs,激活骨髓間充質干細胞MSCs內(nèi)的TGF-β通絡,誘導MSCs細胞內(nèi)smad2/3磷酸化。我們做了體外細胞培養(yǎng)及Western blot實驗。實驗結果表面,TGF-β可以直接激活骨髓間充質干細胞MSCs內(nèi)的TGF-β通路誘導smad2/3磷酸化。然而若提前給予細胞常山酮處理,將會降低骨髓間充質干細胞MSCs的smad2/3的磷酸化。同時我們發(fā)現(xiàn),常山酮對骨髓間充質干細胞MSCs的smad2/3磷酸化的抑制具有時間和劑量依賴性。smad2/3的磷酸化會隨著劑量的不斷增大而減少,當劑量達到1000nM時,smad2/3的磷酸化被完全抑制。同時,當我們增加常山酮的作用時間時,對smad2/3的磷酸化的抑制強度也逐漸增強。我們在動物實驗上進一步驗證了常山酮對smad2/3磷酸化通路的影響。我們發(fā)現(xiàn)鼠行前交叉韌帶離斷術后(ACLT),軟骨下骨的psmad2/3顯著增加。給予常山酮治療顯著降低了psmad2/3的含量(F=8307.104,P0.001))。這些實驗結果表明,常山酮可以直接作用于骨髓間充質干細胞MSCs,抑制MSCs的TGF-β信號通路,抑制smad2/3的磷酸化。從而調(diào)節(jié)了軟骨下骨未偶聯(lián)的骨重塑,并最終延緩了骨性關節(jié)炎的發(fā)生和進展。4,常山酮對軟骨下骨異常血管形成的影響軟骨下骨的異常血管形成對骨性關節(jié)炎的發(fā)生至關重要。骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中,軟骨下骨血管的數(shù)量和體積均增加。異位骨島的形成在骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中的作用至關重要。血管為骨島的形成提供所必須的MSCs,同時也為骨組織提供必需的氧氣及營養(yǎng)物質。我們通過基于三維CT的血管造影的發(fā)現(xiàn),在骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中,軟骨下骨的血管數(shù)量和總量均增加。同時常山酮抑制或減少了軟骨下骨血管的體積和數(shù)量。骨的形成總是伴隨著血管的生成。H型血管,是最近剛被篩選出來的一種只出現(xiàn)在骨組織的血管,且只在骨形成的過程中,即這種H型血管偶聯(lián)了骨的形成和血管的形成。這種血管以雙染CD31和Endomucin均陽性為特征(CD31+ Endomucin+)。在骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中,異常的骨質增生即異常的異位骨島形成在骨性關節(jié)炎發(fā)病過程中起了重要的作用。軟骨下骨異位骨島改變了關節(jié)內(nèi)的受力環(huán)境,使軟骨經(jīng)受異常的力學刺激,而引起關節(jié)軟骨基質的破壞及軟骨的退行性病變。CD31+ Endomucin+血管是一種特異的偶聯(lián)骨形成的血管。因為我們認為在骨性關節(jié)炎發(fā)病過程中,軟骨下骨異位骨島的形成伴隨著CD31+ Endomucin+血管的形成,因其偶聯(lián)骨形成。因此我們做了免疫雙染。免疫結果顯示,前交叉韌帶離斷術后(ACLT),鼠軟骨下骨CD31+ Endomucin+血管的數(shù)量明顯增加,同時,常山酮抑制了CD31+Endomucin+血管的生成。這種抑制可能是由于常山酮抑制了TGF-β信號通路,從而減少了MSCs細胞的動員和招募,MSCs可以和內(nèi)皮前體細胞(EPCs)相互作用以促進骨形成。同時我們在試驗中還發(fā)現(xiàn),常山酮除了抑制轉化生長因子TGF-p的信號通路外,在抑制血管形成的作用中,常山酮還抑制了血管內(nèi)皮細胞的增生。我們發(fā)現(xiàn),安慰劑治療組的鼠軟骨下骨內(nèi)皮細胞的增生明顯增加,而常山酮組軟骨下骨內(nèi)皮細胞的增生與對照組相似,意味著常山酮抑制了血管內(nèi)皮細胞的增生。同時我們還發(fā)現(xiàn)常山酮抑制了基質金屬蛋白酶(MMP-2)的活性�；|金屬蛋白酶(MMP-2)是在血管形成中研究較多的一種蛋白酶,主要作用血管基底膜的Ⅳ型膠原纖維,裂解Ⅳ型膠原纖維以促進新生血管形成。我們發(fā)現(xiàn)安慰劑治療組基質金屬蛋白酶(MMP-2)的含量明顯增高,而常山酮明顯降低了基質金屬蛋白酶(MMP-2)了含量。綜上所述,常山酮可以通過抑制異常血管的形成來調(diào)節(jié)軟骨下骨的骨重塑并最終緩解骨性關節(jié)炎的發(fā)生。四、結論1,常山酮緩解了關節(jié)軟骨的破壞從而延緩了骨性關節(jié)炎的發(fā)生,這一作用是通過調(diào)節(jié)軟骨下骨的異常的骨重塑抑制軟骨下骨異位骨島的形成來實現(xiàn)的；2,常山酮抑制了軟骨下骨Thl7細胞從而減少了軟骨下骨異常增多的骨吸收進而減少了過多的活性的TGF-p的釋放；3,常山酮抑制了骨髓間充質干細胞MSCs的TGF-β依賴的smad2/3信號通路。4,常山酮抑制了軟骨下骨異常的血管形成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5

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6 武W毶，

本文編號：1453304