本文關(guān)鍵詞： 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 白細(xì)胞介素-10 創(chuàng)面愈合 轉(zhuǎn)化生長因子-1 基質(zhì)金屬蛋白酶1 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:探討IL-10基因修飾的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(IL-10-h AMSCs)在創(chuàng)面愈合過程中的促創(chuàng)面愈合作用及其與瘢痕形成相關(guān)因子TGF-β1、MMP-1及TIMP-1表達(dá)變化的關(guān)系,為今后IL-10-h AMSCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合、減輕創(chuàng)面纖維化的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1、采用機(jī)械分離聯(lián)合胰酶-膠原酶二步消化法從人羊膜分離提取h AMSCs,用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基,置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng),并傳至3代備用。2、將克隆的小鼠IL-10基因鏈接到LV5載體中,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定,在293T細(xì)胞中包裝LV5-IL-10慢病毒載體,再轉(zhuǎn)染h AMSCs,獲得IL-10-h AMSCs,熒光顯微鏡下通過綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)情況觀察、評估病毒轉(zhuǎn)染情況及轉(zhuǎn)染效率。3、取第3代生長活躍的h AMSCs、IL-10-h AMSCs和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的h AMSCs,用ELISA試劑盒對上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行TGF-β1分泌量的檢測分析。4、取7周齡C57BL/6野生型雄性小鼠100只,隨機(jī)分為空白組、模型組、h AMSCs組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染h AMSCs組、IL-10轉(zhuǎn)染h AMSCs組,每組20只。腹腔麻醉后,在小鼠背部中線兩側(cè)分別制作1cm×1cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,根據(jù)分組不同,在創(chuàng)面建立即刻于每個創(chuàng)面周圍皮下多點(diǎn)(創(chuàng)緣各邊中點(diǎn)距創(chuàng)面1mm處)注射100μL PBS懸浮的不同組別的h AMSCs(細(xì)胞總數(shù)為1×106個),模型組小鼠則注射等量的PBS,空白組為不進(jìn)行造模及干預(yù)的正常小鼠。另取3只模型小鼠,分別注射IL-10-h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs和CM-Dil標(biāo)記的h AMSCs,用于熒光示蹤移植細(xì)胞的定植存活情況。5、細(xì)胞移植后1天、3天、7天、14天分別觀察各組小鼠創(chuàng)面的紅、腫、滲出及創(chuàng)面愈合情況,計(jì)算創(chuàng)面愈合率。再對各時間點(diǎn)切取的創(chuàng)面及創(chuàng)緣組織,分別進(jìn)行石蠟切片HE染色觀察創(chuàng)面及創(chuàng)緣炎性細(xì)胞的浸潤情況;Masson染色觀察創(chuàng)面及創(chuàng)緣膠原沉積情況,計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù);免疫組化觀察TGF-β1、MMP-1、TIMP-1表達(dá)情況;ELISA觀察創(chuàng)面創(chuàng)緣組織中TGF-β1、MMP-1、TIMP-1含量;q PCR檢測創(chuàng)面創(chuàng)緣組織TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的表達(dá)情況。結(jié)果:1、h AMSCs貼壁細(xì)胞形態(tài)為長梭形、多邊形,細(xì)胞間相互交聯(lián),呈巢狀或漩渦狀排列。傳代后,細(xì)胞貼壁生長速度加快,24 h后即可完全貼壁,細(xì)胞呈梭形,相互交聯(lián)緊密,成巢狀生長。2、IL-10基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果顯示目的基因克隆存在,慢病毒滴度測定結(jié)果為1×108TU/ml,IL-10慢病毒及空質(zhì)粒感染h AMSCs72 h后于倒置顯微鏡下觀察可見視野中多數(shù)細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光,表明感染率高。3、細(xì)胞上清液ELISA結(jié)果顯示:培養(yǎng)基組TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分別為0.47±0.34ng/L,0.33±0.22ng/L,0.27±0.21ng/L,0.25±0.15ng/L。h AMSCs組TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分別為3.26±0.26ng/L,6.37±0.34ng/L,9.86±0.43ng/L,9.08±0.50ng/L。IL-10-h AMSCs組TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分別為6.35±0.48ng/L,10.2±0.54ng/L,14.96±0.67ng/L,13.92±0.41ng/L�？召|(zhì)粒組TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分別為3.23±0.30ng/L,6.30±0.31ng/L,9.30±0.22ng/L,9.13±0.43ng/L。h AMSCs組及空質(zhì)粒組與IL-10-h AMSCs組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。h AMSCs組及空質(zhì)粒組之間無差異(P0.05)。提示體外培養(yǎng)過程中h AMSCs能分泌TGF-β1,IL-10可以促進(jìn)h AMSCs分泌TGF-β1。4、小鼠背部全層皮膚缺損模型建立后1d、3d觀察IL-10-h AMSCs組紅、腫、滲出弱于模型對照組、h AMSCs組、空質(zhì)粒組。7d觀察h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組、IL-10-h AMSCs組的創(chuàng)面愈合速度快于模型對照組,紅、腫及滲出明顯減弱,且IL-10-h AMSCs組的愈合速度、紅、腫、滲出減弱強(qiáng)度均優(yōu)于h AMSCs組、和空質(zhì)粒-h AMSCs組。14d除模型對照組外,創(chuàng)面均100%愈合,且瘢痕增生程度小于模型對照組,IL-10-h ASMCs組最優(yōu)。結(jié)果提示h AMSCs組、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組-h AMSCs創(chuàng)面創(chuàng)面愈合優(yōu)于模型對照組,IL-10-h AMSCs組優(yōu)于h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組,以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。h AMSCs利用CM-Dil染色,IL-10-h AMSCs及空質(zhì)粒-h AMSCs本身表達(dá)GFP,建模移植注射后14天取組織塊切取冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察可見散在熒光分布,表明h AMSCs、IL-10-h AMSCs及空質(zhì)粒-h AMSCs在組織內(nèi)定植并存活。5、HE結(jié)果提示:在顯微鏡下觀察正常小鼠皮膚組織HE染色,可見表皮完整,伴有毛囊,1d時觀察模型對照組、h AMSCs組、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組的小鼠創(chuàng)面及創(chuàng)緣均可見大量炎性細(xì)胞浸潤,創(chuàng)面上方部分組織壞死結(jié)痂,IL-10-h AMSCs組炎性浸潤相比其他組稍少,3d時h AMSCs移植組、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組炎性細(xì)胞浸潤量明顯少于模型對照組,h AMSCs組、空質(zhì)粒組、IL-10-h AMSCs組膠原形態(tài)較一致,間隙適中,模型對照組膠原大小不一,排列疏松且紊亂。7d時模型對照組仍有炎性細(xì)胞浸潤,且成纖維細(xì)胞數(shù)量大,膠原多且密集,h AMSCs移植組、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒組-h AMSCs炎性細(xì)胞浸潤較前降低,且均少于模型對照組,IL-10-h AMSCs組炎性浸潤程度最弱,成纖維細(xì)胞量最少,膠原排列有序;h AMSCs組、空質(zhì)粒組、IL-10-h AMSCs組膠原大小一致,模型對照組膠原數(shù)量多排列紊亂。14d時模型對照組有少量炎性浸潤,h AMSCs移植組、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒組創(chuàng)面炎性細(xì)胞未見明顯炎性細(xì)胞,膠原形態(tài)一致,模型對照組成纖維細(xì)胞明顯多余其他三組。在顯微鏡下觀察空白組正常小鼠皮膚組織Masson染色切片膠原纖維染呈藍(lán)色,排列有序,間隙適中。1d,各組均見大量壞死組織和炎性細(xì)胞浸潤。3d,模型對照組膠原數(shù)量少且間隙較寬,排列紊亂,大小不一,且大量炎性細(xì)胞浸潤,h AMSCs組、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組相比模型對照組,數(shù)量多,呈絲條狀,排列相對有序。IL-10-h AMSCs組形態(tài)一致,交聯(lián)密切,容積分?jǐn)?shù)優(yōu)于其他三組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7d,h AMSCs組、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組較模型對照組膠原排列呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),膠原間隙適中,數(shù)量稍有減少。模型對照組膠原纖維呈旋渦狀排列,紊亂無序,膠原粗大且數(shù)量多,膠原間隙致密,IL-10-h AMSCs組與其他三組相比容積分?jǐn)?shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。14d,各組膠原均穩(wěn)定形成,相對于其它各組,模型對照組排列緊密,成纖維數(shù)量多,而IL-10-h AMSCs組成纖維細(xì)胞相對較少,膠原排列近似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、間隙適中,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P0.05)免疫組化結(jié)果顯示:空白組正常小鼠皮膚可見少量TGF-β1、MMP-1、TIMP-1陽性表達(dá),陽性結(jié)果均為胞漿棕黃色。TGF-β1結(jié)果:建模后1d、3d,模型對照組可見TGF-β1陽性率逐漸增高,3d時,IL-10-h AMSCs組增高最明顯(P0.05);建模后7d、14d,與模型對照組比較,h AMSCs、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒組TGF-β1陽性率明顯下調(diào),7d、14d均為IL-10-h AMSCs組下降最明顯(P0.05)。MMP-1結(jié)果:建模后1d、3d,各組見MMP-1陽性率逐漸升高,與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);除空白組外四組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。建模后7d,與模型對照組比較,h AMSCs、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組陽性率明顯增高,且IL-10-h AMSCs組增高最明顯(P0.05),14d,各組陽性率均下降,模型對照組、h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組陽性率下降明顯,三組之間無差異(P0.05),但模型對照組、h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組與IL-10-h AMSCs組差異明顯(P0.05)。TIMP-1結(jié)果:1d、3d、7d,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組、模型對照組含量逐漸升高,各時間點(diǎn)與空白組相比差異明顯(P0.05)。7d時,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組與模型對照組相比差異明顯(P0.05),IL-10-h AMSCs組與空質(zhì)粒組、h AMSCs組相比差異明顯(P0.05)。14d,模型對照組含量明顯增高,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組含量增高不明顯,與模型對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6、ELISA法和q PCR檢測小鼠背部創(chuàng)面及創(chuàng)緣組織結(jié)果顯示TGF-β1含量及mRNA相對表達(dá)量:結(jié)果可見空白組正常小鼠皮膚組織TGF-β1較低,1d、3d、7d模型對照組TGF-β1含量逐漸增高,7d達(dá)峰值后逐漸開始下降,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組較模型對照組1d、3d的TGF-β1明顯增高,且IL-10-h AMSCs組升高更明顯,7d時IL-10-h AMSCs組與空質(zhì)粒-h AMSCs組、h AMSCs組TGF-β1明顯含量減少,IL-10-h AMSCs組減少最多,且三組含量均少于模型對照組,以上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。提示IL-10-h AMSCs在創(chuàng)面愈合過程的1d、3d促進(jìn)創(chuàng)面分泌TGF-β1,7d后可以抑制創(chuàng)面中的TGF-β1的分泌,使其減少。MMP-1濃度及mRNA相對表達(dá)量:結(jié)果可見空白組正常小鼠MMP-1含量較低,其余四組的MMP-1含量1d、3d逐漸增高,7d達(dá)峰值后逐漸開始下降。h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空質(zhì)粒組較模型對照組1、3、7d的MMP-1含量少,且IL-10-h AMSCs組含量最少,7d,四組MMP-1含量均增高,且IL-10-h AMSCs組與空質(zhì)粒-h AMSCs組、h AMSCs組、模型對照組相比,MMP-1含量明顯多于以上三組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果表明正常皮膚MMP-1表達(dá)極低。IL-10-h AMSCs可以增加創(chuàng)面MMP-1含量。TIMP-1濃度及mRNA相對表達(dá)量:結(jié)果可見空白組正常小鼠TIMP-1含量較低,其余四組的TIMP-1含量逐漸增高,1、3、7d,h AMSCs和IL-10-h AMSCs、空質(zhì)粒-h AMSCs組較模型對照組的TIMP-1含量高。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),14d,模型對照組含量明顯增高,余三組含量增高不明顯,h AMSCs、IL-10-h AMSCs組、空質(zhì)粒-h AMSCs組與空白組及模型對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果表明正常皮膚TIMP-1表達(dá)極低。IL-10-h AMSCs可以在創(chuàng)面中增高TIMP-1含量。TIMP-1/MMP-1比值:1d、7d時,各組比值相差不大,3d時,IL-10-h AMSCs比值大于模型對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(P0.05);14d,IL-10-h AMSCs比值小于模型對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、創(chuàng)面形成后局部移植IL-10-h AMSCs可通過先升高后降低的方式影響創(chuàng)面TGF-β1表達(dá),促進(jìn)創(chuàng)面愈合,控制創(chuàng)面的炎癥反應(yīng),改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。2、IL-10-h AMSCs在創(chuàng)面愈合中可下調(diào)TIMP-1/MMP-1比值,改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R641

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 侯劍輝;葉博然;劉鈺君;陳f^明;陳盛強(qiáng);;TGF-β1在慢性充血性心力衰竭中的表達(dá)及其作用[J];現(xiàn)代醫(yī)院;2013年03期

2 張瑩,張郁,孫葉方,史俊南;TGF-β對人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞堿性磷酸酶的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;1999年04期

3 周紅,馬忠森,王秀麗,安繼紅,赫國志;TGF_(β1)和TGF_βR在煤工塵肺大鼠模型肺組織中的表達(dá)[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年02期

4 宋雅芳,洪嘉禾,徐列明;中醫(yī)藥對TGF-β1調(diào)控作用的研究進(jìn)展[J];上海中醫(yī)藥雜志;2004年01期

5 鄒貴勉,張t，

本文編號：1444430