本文關(guān)鍵詞： 多發(fā)性硬化 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 p38絲裂原活化蛋白激酶 血清和糖皮質(zhì)激素活化蛋白激酶1 氧化應(yīng)激 去甲二氫愈創(chuàng)木酸　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：多發(fā)性硬化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病,是中青年神經(jīng)致殘的重要原因。該病發(fā)病機制復(fù)雜、尚未闡明,現(xiàn)有觀點認為環(huán)境因素和遺傳易感性共同參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。多發(fā)性硬化病理學(xué)特征是炎性細胞浸潤、髓鞘脫失和繼發(fā)軸索損傷。鑒于目前尚無有效治療手段,深入探討多發(fā)性硬化的發(fā)病機制將有助于發(fā)掘潛在臺療靶點。實驗性自身免疫性腦脊髓炎EAE是多發(fā)性硬化的動物模型,具有與多發(fā)性硬化類似的進展性神經(jīng)功能缺損和典型病理特征。目前所有多發(fā)性硬化的疾病修正治療手段均對EAE有效,其中一些藥物就來源于對EAE的研究,這印證了EAE對多發(fā)性硬化高度的模擬度�？乖禺愋訲細胞誘導(dǎo)的免疫炎癥是多發(fā)性硬化發(fā)生發(fā)展的最重要因素。Thl細胞和Th17細胞均是多發(fā)性硬化的參與者,而抗原持異性Th17細胞則是經(jīng)典EAE的主要推動者。CD4+T細胞引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性級聯(lián)反應(yīng),其他免疫細胞和固有細胞產(chǎn)生氧自由基等毒性物質(zhì)攻擊少突膠質(zhì)細胞。少突膠質(zhì)細胞-髓鞘-軸索單位損傷造成神經(jīng)信號傳導(dǎo)障礙,繼而引起多發(fā)性硬化的神經(jīng)功能缺損癥狀。氧化立激參與多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧簇,消耗為源性抗氧化酶。高濃度氧自由基能夠破壞血腦屏障、促進白細胞遷移、介導(dǎo)髓鞘脫失和軸索損傷。氧化應(yīng)激還能夠通過激活多種信號通路加重自身免疫炎癥。但在眾多途徑中何種通路發(fā)揮關(guān)鍵性作用尚不明確。發(fā)病機制的研究一度給藥物研發(fā)帶來希望,但無論是免疫調(diào)節(jié)治序還是抗氧化治療均未顯示出理想效果。另外,多發(fā)性硬化中免疫炎癥和氧化應(yīng)激的相互作用機制尚不清楚,氧化應(yīng)激通過何種具體途徑參與炎癥損傷仍待探究。新藥研發(fā)的困境更凸顯機制研究的迫切性。節(jié)者,對Th17細胞發(fā)揮免疫功能至關(guān)重要。近年來一系列研究凸顯該通路在多發(fā)性硬化及EAE發(fā)病中占據(jù)重要地位,深入探討p38MAPK-SGK1通路作用機制可能會為多發(fā)性硬化的治療研究帶來新思路。在脫髓鞘疾病中,p38MAPK既能夠被氧化應(yīng)激激活又在Th17炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,故推測p38MAPK-SGK1通路是免疫炎癥和氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián)樞紐,氧化應(yīng)激通過p38MAPK-SGK1途徑參與免疫炎癥。本研究旨在通過干預(yù)劑對比研究,證實氧化應(yīng)激-p38MAPK-SGK1致病通路在EAE發(fā)病機制中占據(jù)核心地位。此外,既往研究發(fā)現(xiàn)去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)能夠通過抑制氧化應(yīng)激減輕自身免疫炎癥,有效治療EAE。本實驗希望探討其療效是否部分來源于對氧化應(yīng)激-p38MAPK-SGK1改病通路的抑制。方法：1 EAE模型建立將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成10mg/ml,并按1：1等體積加入完全弗氏佐劑(其中結(jié)核桿菌H37Ra終濃度為4mg/ml)混合。乳化后以每只250ug/0.1ml于小鼠脊柱兩側(cè)分四點進行皮下注射,免疫當天(即第0h)及第2天(即48h)分兩次腹腔注射05ml PTX(500ng/只上述免疫過程在乙醚麻醉及充分固定下進行。2 EAE神經(jīng)功能評分和干預(yù)建立EAE模型后分別用SB203580、Tempol和NDGA干預(yù)EAE小鼠。自免疫后第1天開始,SB203580組小鼠SB203580 5mg/kg, TEMPOL組小鼠TEMPOL 25mg/kg, NDGA組小鼠每日腹腔注射NDGA 10mg/kg,空白對照組及EAE組小鼠每日腹腔注射等量的生理鹽水。神經(jīng)功能評分采用國際通用的VWerver (15分)評分標準：尾部-0分：無癥狀；1分：尾部張力減低或遠端癱；2分：全癱。肢體——0分：無癥狀；1分：步態(tài)笨拙；2分：輕癱,拖曳；3分：全癱,外翻。根據(jù)尾部和每個肢體情況累加計分。15分為瀕死。3組織病理學(xué)觀察小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,4%多聚甲醛灌流,取脊髓腰骶段石蠟包埋,5μm連續(xù)切片。在光鏡下,通過HE染色觀察小鼠脊髓腰膨大處炎性細胞浸潤,每只小鼠取3張脊髓組織切片,對每張脊髓切片選取5個高倍(400)視野進行炎性浸潤情況評分,計算每只小鼠平均炎性評分。HE染色炎癥評分標準：0分,無炎性細胞浸潤；1分,散在炎性細胞浸潤；2分,血管周圍炎性細胞浸潤；3分,“血管套袖”形成并累及周圍組織。通過LFB染色觀察小鼠脊髓腰膨大處髓鞘脫失情況,每只小鼠取3張脊髓組織切片,對每張脊髓切片選取5個高倍(400)視野進行髓鞘脫失情況評分,計算每只小鼠平均髓鞘脫失評分。LFB評分標準：0分,無髓鞘脫失；1分,稀少的髓鞘脫失；2分,多發(fā)的髓鞘脫失；3分,大片狀、融合的髓鞘脫失。用免疫組織化學(xué)染色方法觀察小鼠脊髓p38、p-p38、SGK1、 IL-17、RORγt和HO-1表達。將染色后的脊髓組織切片于光學(xué)顯微鏡下進行觀察,陽性細胞：可見棕黃顆粒；陰性細胞：無棕黃顆粒。每只小鼠選擇3張組織片,每張組織片隨機選取5個高倍視野在10×40陪光學(xué)顯微鏡下進行觀察,對細胞核完整的免疫陽性細胞進行計數(shù),計算出每組小鼠每個時間點的陽性細胞個數(shù)的平均值。自對照組和干預(yù)組各取材1只小鼠,用2.5%戊二醛灌注固定半小時以后,取脊髓保存于4%戊二醛電鏡保存液中數(shù)天,取脊髓后索部位用新鮮刀片切成1mm正方形小塊,經(jīng)過餓酸固定,梯度脫水,包埋劑浸透包埋,修塊,切片等過程后制成切片在透射電鏡下定性觀察髓鞘和軸索的形態(tài)學(xué)變化。4Western blot去檢測p38MAPK、p-p38MAPK、SGK1、IL-17、 OROγt和HO-1從脊髓細胞中提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度上樣,之后電泳,濃縮膠：80V；分離膠：100V，，直到所需marker條帶跑完后停止電泳。電泳結(jié)束后,使用轉(zhuǎn)移電泳裝置,在4℃,100V恒玉條件下電轉(zhuǎn)120min,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)室溫封閉PVDF膜1小時。一抗孵育：封閉液稀釋抗體,然后與封閉好的PVDF膜4℃過夜。二抗孵育：用封閉液稀釋相應(yīng)的二抗,室溫下孵育PVDF膜。將膜經(jīng)凝膠成像儀成像,用軟件image J測得得出各標本目的蛋白即p38MAPK、p-p38MAPK、 IL-17、RORγt和HO-1條帶灰度相對值及對應(yīng)內(nèi)參的灰度值,兩者相北,算得比值。5MDA檢測方法檢測各種小鼠脊髓MDA含量,以評估組織氧化應(yīng)激水平。采用硫代巴比妥酸(TBA)法,利用多功能酶標儀SynergyHT型于波長532nm處測定,含量單位為nmol/mgprot.測定原理為過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合,從而形成紅色產(chǎn)物,在532nm處有最大吸收峰。6 RT-PCR檢測p38MAPK、SGK1、NFAT5和HO-1mRNA表達情況首先從脊髓細胞中提取總RNA,鑒定RNA純度和濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。之后采用sybr green法檢測擴增變化。采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。計算方法是：目的基因相對表達倍數(shù)=2-△△C(t),c(t)值是熱循環(huán)儀中熒光達到熒光閾值的循環(huán)數(shù),根據(jù)△c(t)實驗組=C(t)目的基因-c(t)ACTIN,△c(t)對照組=c(t)目的基因-c(t)ACTIN,△△c(t)=Δc(t)實驗組-△c(t)對照組,對每一標本計算目的基因相對于對照組基因的相對定量結(jié)果。即其他各個樣品相對于對照樣品,目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。7統(tǒng)計方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗所測得數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,以“均數(shù)±標準差”表示。發(fā)病率用用卡方檢撿進行統(tǒng)計學(xué)分析,以百分比表示。多組計量資料均數(shù)的比較：方差齊時應(yīng)用ONE-WAY-ANOVA中SNK-q檢驗進行方差分析,方差不齊時立用非參數(shù)秩和檢驗。以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1本研究觀察了EAE發(fā)病過程中免疫炎癥、氧化應(yīng)激和)38MAPK-SGK1通路的動態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)隨著EAE進展,小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷加重,Th17細胞增多,p38MAPK-SGK1通路因子表p38MAPK-SGK1通路還是氧化應(yīng)激水平的動態(tài)變化,都呈現(xiàn)出與EAE臨床病程的一致性,提示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫炎癥中二者可能存在較強關(guān)聯(lián)。2應(yīng)用p38MAPK抑制劑SB203580和抗氧化劑Tempol干預(yù)EAE小鼠,均顯示出良好的治療效果。干預(yù)組與EAE對照組相比,發(fā)病率降低,發(fā)病時間和癥狀達峰時間延遲,病程各時期神經(jīng)功能損傷程度減輕。病理損傷方面,小鼠發(fā)病各時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性浸潤程度降低、髓鞘脫失區(qū)域縮小、軸索損傷減輕。免疫組化檢測和Western)1ot均顯示IL-17和RORγt表達降低,提示Th17炎癥反應(yīng)削弱。此外,抗氧化治療展現(xiàn)出對p38MAPK-SGK1通路的強烈抑制作用,顯示氧化應(yīng)激是p38MAPK-SGK1通路的重要上游刺激物。氧化應(yīng)激p38MAPK-SGK1致病通路在EAE發(fā)病機制中占據(jù)核心地位。3通過EAE評分、組織病理學(xué)觀察以及對IL-17和RORγt勺蛋白含量檢測,本研究發(fā)現(xiàn)NDGA成功改善了EAE臨床癥狀和病理損防,削弱了中樞神經(jīng)系統(tǒng)Th17炎癥反應(yīng),顯示出與SB203580和Tempol相同的良好治療效果。在NDGA干預(yù)下,EAE小鼠脊髓MDA含量下降、HO-1表達升高,p-p38MAPK和SGK1含量明顯降低,顯示NDGA通過抗氧化和抑制p38MAPK炎性反應(yīng)雙重作用治療EAE。結(jié)論：本實驗應(yīng)用MOG35-55免疫C57BL/6雌性小鼠成功建立EAE模型,印證了EAE炎性浸潤、髓鞘脫失的病理特征,并發(fā)現(xiàn)EAE發(fā)病過程中,T細胞反應(yīng)、氧化應(yīng)激和p38MAPK-SGKl通路三者的動態(tài)變化呈現(xiàn)一致性。p38MAPK抑制劑SB203580和抗氧化劑Tempol干預(yù)各自成功改善了EAE臨床癥狀和病理損傷,削弱了中樞神經(jīng)系統(tǒng)Th17炎癥反應(yīng),并顯示出相同的作用效果,抗氧化治療還展現(xiàn)出對p38MAPK-SGK1通路的強烈抑制作用。這不僅確證了EAE中p38MAPK通路和氧化應(yīng)激各自的重要地位,更顯示氧化應(yīng)激通過p38MAPK-SGK1通路促進Th17細胞免疫應(yīng)答,進而引發(fā)炎性浸潤、髓鞘脫失等病理損傷,導(dǎo)致上升性弛緩性癱等臨床癥狀。氧化應(yīng)激p38MAPK-SGK1致病通路在EAE發(fā)病機制中占據(jù)核心地位。去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)具有抗氧化和抗炎性反應(yīng)雙重屬性,在EAE中以氧化應(yīng)激p38MAPK-SGK通路為靶點發(fā)揮多重保護作用,作為多發(fā)性硬化的潛在治療藥物,具有廣闊研究前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R744.51

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