本文關(guān)鍵詞：CXCR4基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞治療兔椎間盤退變的實驗研究　出處：《東南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分：兔骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及鑒定目的：體外分離、培養(yǎng)和擴增的新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs).對培養(yǎng)細胞進行鑒定,為后續(xù)實驗提供細胞來源。方法：麻醉后無菌獲取2周齡新西蘭大白兔股骨及脛骨,剪開髓腔,獲取骨髓液,用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng),通過傳代純化篩選得到MSCs,應(yīng)用MTT法繪制細胞生長曲線,從細胞形態(tài)、流式細胞儀分析表面標記物以及成骨、成脂、成軟骨分化等方面鑒定MSCS。結(jié)果：貼壁培養(yǎng)獲取的兔骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)過三代的培養(yǎng)逐漸得到純化,成熟的干細胞在顯微鏡下表現(xiàn)為短梭形,輪廓清楚,胞核明顯,呈圓形,核質(zhì)比大。細胞融合后傳代培養(yǎng)生長迅速,生長力旺盛,數(shù)日即能再次融合,流式細胞儀結(jié)果顯示MSCs細胞均一性好,97%以上細胞表達干細胞表型CD29、CD90,不表達造血細胞表型CD45及CD34。經(jīng)過誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后MSCs向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞分化,具有干細胞多能橫向分化潛能。結(jié)論：利用貼壁法培養(yǎng)獲得的兔MSCs,經(jīng)過傳代純化后可以得到純度較高的MSCs,所得細胞具有干細胞特性,能多向分化,可作為再生醫(yī)學(xué)的種子細胞。第二部分：CXCR4基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞目的：探討運用慢病毒介導(dǎo)CXCR4基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞的方法及其提高細胞體外遷移能力的可行性。方法：用慢病毒表達載體Rabbit CXCR4-pIRES2-EGFP(前期構(gòu)建)和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝病毒,收集病毒原液,超速離心濃縮,并測定滴度,慢病毒感染MSCs。轉(zhuǎn)染后用臺盼藍染色觀察其細胞活力。通過QPCR的方法從mRNA水平檢測CXCR4基因在MSCs中表達,用Western blot法檢測CXCR4蛋白的含量。通過Transwell趨化實驗來檢測經(jīng)過CXCR4轉(zhuǎn)染后的MSCs向SDF-1趨化能力的變化。結(jié)果：CXCR4基因轉(zhuǎn)染后的兔MSCs能成功表達CXCR4,轉(zhuǎn)染后干細胞的CXCR4的基因水平和蛋白水平均顯著升高。臺盼藍染色顯示轉(zhuǎn)染前后細胞活力無明顯改變。Transwell趨化實驗表明轉(zhuǎn)染CXCR4基因后的MSCs對SDF-1的趨化能力,比未轉(zhuǎn)染的MSCs明顯升高(P0.05)。加入CXCR4阻斷型抗體AMD3100可有效抑制基因修飾細胞向SDF-1的遷移。結(jié)論：通過慢病毒載體能成功將CXCR4基因轉(zhuǎn)染至兔MSCs,轉(zhuǎn)染后對干細胞活力無明顯影響,轉(zhuǎn)染后干細胞高表達CXCR4,并能明顯提高MSCs向SDF-1趨化的能力。第三部分高表達CXCR4的間充質(zhì)干細胞對正常椎間盤退變的影響目的：初步探討高表達CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細胞對正常椎間盤退變的延緩作用,為CXCR4-MSCs治療椎間盤退變提供方法及理論基礎(chǔ)。方法：通過慢病毒載體介導(dǎo)CXCR4基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞,使后者高表達CXCR4。取15只新西蘭大白兔,全身麻醉后經(jīng)腹膜后入路暴露椎間盤,用21G針頭對L3/4、L4/5、L5/6椎間盤穿刺抽吸髓核后,隨即向椎間盤注入20μl PBS或106個/mlCXCR4-MSCs或106個/ml MSCs,從而將實驗分為：PBS組(對照組)、CXCR4-MSCs組和MSCs組。術(shù)后4周、8周從椎間盤高度指數(shù)、組織學(xué)、C012及Aggrecan mRNA含量改變等方面觀察椎間盤改變,評估干細胞治療椎間盤退變的療效。結(jié)果：基因轉(zhuǎn)染后熒光觀察及Western Blot證實干細胞高表達CXCR4。移植術(shù)后4周,三組的椎間盤高度指數(shù)均較移植前明顯下降,但三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)后8周,CXCR4-MSCs組椎間盤高度指數(shù)降低較少,與PBS組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。移植后4周及8周,組織學(xué)可見CXCR4-MSCs組和MSCs組移植后椎間盤退變相對PBS組顯著減慢,表現(xiàn)出一定的延緩?fù)俗冏饔�。RT-PCR結(jié)果表明,術(shù)后8周,CXCR4-MSCs組和MSCs組Aggrecan mRNA相對表達量較PBS組多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；術(shù)后8周三組間Col2 mRNA表達無顯著性差別。結(jié)論：CXCR4基因轉(zhuǎn)染MSCs能移植椎間盤明顯提高髓核Aggrecan mRNA表達,提高椎間盤高度指數(shù),延緩椎間盤退變。第四部分：兔椎間盤退變模型的制作與評價目的：建立一種簡單、有效、可重復(fù)的新西蘭大白兔椎間盤退變模型。方法：取健康成年新西蘭大白兔18只,體重在4.4±0.27kg,雌雄不限,排除脊柱畸形。1%戊巴比妥鈉麻醉后經(jīng)腹膜后入路暴露L3/4、L4/5、L5/6三個椎間盤,采用21號針頭從椎間盤側(cè)前方刺入,采用自制的限制器將穿刺深度控制在5mm,穿刺針在椎間盤內(nèi)停留5秒,負壓抽出髓核組織,反復(fù)穿刺三次。以L2/3,L6/7為對照。術(shù)后2、4、8周隨機選取6只兔子行腰椎X線攝片測量椎間盤高度指數(shù)及MRI掃描觀察椎間盤T2信號強度,然后過量麻醉處死,行HE染色,觀察椎間盤退變情況并對切片進行組織學(xué)評分。結(jié)果：穿刺術(shù)后所有動物均存活,一例動物出現(xiàn)局部感染,對癥處理后好轉(zhuǎn)：X線可見術(shù)后2周,椎間盤高度開始下降,4周加重,術(shù)后8周出現(xiàn)椎間隙狹窄；MRI觀察發(fā)現(xiàn),術(shù)后2周開始出現(xiàn)退變,此后纖維環(huán)穿刺組術(shù)后椎間盤信號強度呈持續(xù)減弱趨勢,椎間盤高度也不斷下降,8周表現(xiàn)為黑色椎間盤,嚴重退變。HE染色結(jié)果表明：椎間盤穿刺造模后,髓核體積減小和細胞減少,纖維環(huán)排列紊亂,髓核皺縮并與纖維環(huán)逐漸分離。對椎間盤切片的組織學(xué)評分結(jié)果進行統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)穿刺后的椎間盤在術(shù)后2、4、8周與對照組相比,評分明顯升高,差異均有顯著性意義(p0.01),說明穿刺成功地誘導(dǎo)椎間盤退變。結(jié)論：纖維環(huán)穿刺法可以誘導(dǎo)兔椎間盤緩慢退變,可為后續(xù)研究提供可靠的動物模型。第五部分CXCR4基因轉(zhuǎn)染干細胞治療椎間盤退變目的：評估高表達CXCR4的間充質(zhì)干細胞能否增強干細胞再生椎間盤的能力,CXCR4基因轉(zhuǎn)染干細胞后能否促進干細胞在椎間盤內(nèi)的遷移。方法：體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,慢病毒介導(dǎo)CXCR4基因轉(zhuǎn)染MSCs,使其高表達CXCR4,然后SPIO標記,移植到退變的椎間盤內(nèi),以MSCs和等體積PBS為對照。術(shù)后8周、16周通過X線檢測椎間盤高度指數(shù)變化,MR示蹤干細胞在椎間盤內(nèi)分布,切片普魯士藍染色對照, RT-PCR檢測椎間盤內(nèi)二型膠原mRNA及aggrecan mRNA表達情況。結(jié)果：在移植即刻MR,可見SPIO標記的MSCs組移植后在椎間盤內(nèi)形成了一個低信號區(qū)域,而PBS組無明顯低信號區(qū)域。8周及16周,CXCR4-MSCs組低信號區(qū)域逐漸分散,這些環(huán)形低信號區(qū)域的半徑較移植時逐漸分散、變小。停留在體內(nèi)的干細胞也被普魯士藍染色所證實。術(shù)后16周,相對于MSCs組,CXCR4-MSCs組可見更多的藍色顆粒細胞存在于椎間盤內(nèi)。在基因表達方面,移植后8周,MSCs組髓核內(nèi)aggrecan及COL2 mRNA表達量較PBS組明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而CXCR4-MSC組髓核內(nèi)aggrecan及COL2 mRNA表達量較PBS組也明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：基因轉(zhuǎn)染的MSCs能高表達CXCR4, CXCR4-MSCs提高干細胞再生椎間盤的能力,促進其在椎間盤內(nèi)停留及遷移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R681.53

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本文編號：1424398