發(fā)布時間：2018-01-14 03:31

  本文關鍵詞：慢病毒介導siRNA干擾ERK2抑制關節(jié)粘連的研究　出處：《天津醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的本課題通過建立兔膝關節(jié)滑膜切除術模型,急性期內(nèi)局部注射攜帶小分子干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的慢病毒,然后通過siRNA干擾ERK2,進而阻斷SMAD和MAPK通路來抑制成纖維細胞增殖和膠原蛋白表達,從而抑制關節(jié)粘連形成。然后觀察其后期效果,并探討其作用機制。 方法選擇健康成年日本大耳白兔30只,隨機分為對照組(A組)、Ms siRNA組(B組)、ERK2siRNA組(C組),每組10只。所有動物在無菌相同的條件下均行右側膝關節(jié)滑膜切除術,并搔剮髕上囊區(qū)域,完成兔膝關節(jié)滑膜切除術模型。手術完畢,將兔右膝關節(jié)用管型石膏固定于屈曲140°位,時間為4周,對左側膝關節(jié)不行任何處理。在切口閉合后的第3天及第7天,A組局部注射0.1ml無病毒載體培養(yǎng)液、B組局部注射0.1ml慢病毒介導的MS siRNA的培養(yǎng)液、C組局部注射0.1ml慢病毒介導的ERK2siRNA的培養(yǎng)液。每組兔子測量膝關節(jié)攣縮角度,方法是采用在固定伸膝力作用下,測量膝關節(jié)攣縮角度。動物麻醉完畢,除去管型石膏,平臥位固定右大腿,將右小腿膝下10cm處用繃帶套住,另一端系彈簧秤,施加均勻的水平牽引力(5N),被動伸直膝關節(jié)。拍攝右膝關節(jié)的X線片,股骨與脛骨長軸的夾角,定義為攣縮角。然后動物行右膝關節(jié)的大體觀察,一盲法觀察者觀測,半定量計分,并作半定量評估。記分標準：無粘連為0分,薄膜樣弱粘連為1分,輕度粘連為2分,中度粘連為3分,嚴重的纖維性粘連為4分。大體觀察之后,將測完角度的兔子處死,在髕上囊處取粘連組織,標本烘干,貯存于-20℃冰箱中。膠原中含有12.5%的羥脯氨酸(質(zhì)量),故可通過測量粘連組織中輕脯氨酸的含量來折算總膠原含量。先測出標準羥脯氨酸濃度的紫外線吸光度,繪制標準曲線紫外線分光光度儀在560μm處測溶液吸光率,再測定樣品羥脯氨酸吸光度,得出羥脯氨酸的含量。進而得出總膠原含量。接著取帶著粘連組織的右膝關節(jié),在10%福爾馬林—10%硝酸混合液中固定脫鈣1周(大頭針可輕松刺入骨組織),沖洗后取髕上囊周圍的粘連組織,經(jīng)常規(guī)處理制成切片。術后28天熒光顯微鏡下觀察局部病毒攜帶siRNA對細胞的轉染情況,并通過蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)和免疫組織化學染色觀察損傷局部組織瘢痕粘連狀況。所有數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS11.0統(tǒng)計軟件包處理,結果用X±S表示。由單因素方差分析組間t檢驗進行比較,以P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結果對照組(A組)、Ms siRNA組(B組)各有一只兔子死亡。1只ERK2siRNA組(C組)兔子因石膏管形出現(xiàn)壓迫性潰瘍不能使用,除去這3只兔子,留有27只動物作為研究對象。熒光顯微鏡下觀察到4w后在關節(jié)腔周圍組織中有大量增強型綠色熒光蛋白得以表達,表達部位主要集中在關節(jié)囊周圍中,并且距損傷邊緣越遠,綠色熒光密度越低。轉染后第28天檢測到的熒光強度表明,熒光素酶基因表達,局部注射的慢病毒介導siRNA成功導入靶細胞。Ms siRNA組(B組)關節(jié)屈曲攣縮的角度(71°-91°,平均82°),與對照組(A組)差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。ERK2siRNA組(C組)關節(jié)屈曲攣縮的角度(250°-38°,平均32°)明顯低于Ms siRNA組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。大體觀察時發(fā)現(xiàn)Ms siRNA組(B組)粘連成較厚的纖維粘連組織,而ERK2siRNA組粘連教薄弱,對照組盲法半定量評分結果是3.14±0.556分,與對照組(A組)差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。而ERK2siRNA組(C組)是2.16±0.408分,明顯低于Ms siRNA組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。生物化學分析測得羥脯氨酸的質(zhì)量,然后利用公式羥脯氨酸的質(zhì)量×8得到膠原的質(zhì)量,這樣lmg干燥粘連組織中的總膠原含量是：Ms siRNA組(B組)134.03±11.68μg,與對照組(A組)差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。ERK2siRNA組(C組)80.06±10.13μg,明顯低于Ms siRNA組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫組化及HE染色觀察到對照組和Ms siRNA組粘連組織致密、粗糙,纖維瘢痕密布,兩者在纖維細胞密度方面相差不大；與之相比,ERK2siRNA組粘連組織稀疏、松散,且纖維細胞密度明顯比Ms siRNA組和對照組低。 結論局部導入慢病毒介導的以ERK2為靶向的siRNA能夠安全有效地改善兔模型中關節(jié)粘連的形成；這項研究可能為預防關節(jié)粘連的形成提供了一種新的途徑,涉及較大的動物及臨床應用尚需進一步的研究。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of SMAD and MAPK pathway on the proliferation and collagen expression of fibroblasts by establishing a model of rabbit knee synovectomy , which can inhibit the proliferation of fibroblasts and the expression of collagen by interfering with ERK2 by siRNA , thus inhibiting the formation of joint adhesion . Methods 30 rabbits were randomly divided into control group ( group A ) , Ms siRNA group ( group B ) and ERK2siRNA group ( group C ) . All the data were treated with SPSS 11.0 statistical software package , and the result was expressed by X 鹵 S . Results Compared with control group ( group A ) , there was no significant difference between ERK2siRNA group ( group C ) and control group ( P0.05 ) . Conclusion Local introduction of lentivirus - mediated siRNA targeting ERK2 can effectively improve the formation of joint adhesions in rabbit model . This study may provide a new way to prevent the formation of joint adhesions , which involves larger animal and clinical application .

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R684

【參考文獻】

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本文編號：1421850