本文關(guān)鍵詞：基于CLSM技術(shù)研究電針對(duì)缺血再灌注大鼠腦內(nèi)MAPK家族信號(hào)通路的影響　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景缺血性腦卒中,是指由于各種因素引起的局部腦組織血液供應(yīng)障礙,進(jìn)而導(dǎo)致腦組織發(fā)生缺血缺氧性病變壞死,在臨床上出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。該疾病的典型特點(diǎn)是：發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高以及并發(fā)癥多,且常留有后遺癥,給社會(huì)及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān),近年來,其發(fā)病年齡也逐漸趨向年輕化,越來越成為威脅人類生命和生活質(zhì)量的重大疾患。因此尋找有效的治療手段并闡釋其作用機(jī)制一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。目前已知腦梗死后50%以上的梗塞血管可以自發(fā)再通,當(dāng)血流再通時(shí),機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞受到相應(yīng)的刺激后發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理變化,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡,從而進(jìn)一步促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能破壞、腦梗死灶形成。醫(yī)學(xué)上將這種由于梗塞血管血流再通所引起的局部組織損傷稱為腦缺血再灌注(Cerebral Ischemia Reperfusion,CIR)損傷。其機(jī)制較為復(fù)雜,目前認(rèn)為主要與過度形成的自由基、炎性反應(yīng)興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)Ca超載、基因異常表達(dá)等有關(guān)。大量文獻(xiàn)報(bào)道絲裂原激活蛋白激酶級(jí)聯(lián)途徑參與腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的損傷或修復(fù),在細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)方面起著關(guān)鍵性的作用。目前已確定的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路至少有6條,其中最具特征研究較多的有：1)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路：其主要對(duì)酪氨酸激酶受體、生長(zhǎng)因子受體、G蛋白偶聯(lián)受體反應(yīng)；2)應(yīng)激活化蛋白激酶SAPK/JNK通路：主要針對(duì)TNFa、IL1和熱反應(yīng)等反應(yīng)；3)p38MAPK通路：主要針對(duì)熱休克、TNFα、IL.1等反應(yīng),當(dāng)腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)此3條主要信號(hào)通路在神經(jīng)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞中均被激活表達(dá)[6]。臨床報(bào)道和實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)針刺療法對(duì)缺血性腦卒中具有獨(dú)特的療效。導(dǎo)師課題組前期分別針對(duì)ERK信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路以及p38MAPK信號(hào)通路展開研究,并取得了一定的成果,采用免疫組織化學(xué)法對(duì)三條通路相關(guān)蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK進(jìn)行檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)電針可以上調(diào)p-ERK的表達(dá)水平,也可以下調(diào)p-JNK、p-38MAPK的表達(dá)水平。推測(cè)電針治療腦缺血再灌注損傷可能與促進(jìn)ERK信號(hào)通路激活有關(guān),也可能與抑制JNK信號(hào)通路、p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。并且在一定程度上為課題組前期提出的“針刺刺激—復(fù)合信號(hào)調(diào)控.良性修養(yǎng)機(jī)制啟動(dòng)是其腦缺血再灌注后治療的關(guān)鍵作用機(jī)制之一”假說提供了依據(jù)。然而電針究竟是通過單純影響某條通路起效,還是順次逐一激活或抑制三條通路,亦或同時(shí)調(diào)節(jié)多條通路共同發(fā)揮作用,尚未完全明確。而且,據(jù)當(dāng)前可查閱文獻(xiàn)資料顯示,對(duì)于該家族信號(hào)通路相關(guān)因子的檢測(cè)方法,目前多采用免疫組織化學(xué)法、蛋白質(zhì)免疫印記法(Western Blot)、逆轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)等,這些方法雖然應(yīng)用廣泛,相對(duì)成熟,但是存在一定的局限性。而免疫熒光雙標(biāo)法則可以實(shí)現(xiàn)在同一組織或細(xì)胞標(biāo)本上同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)。另外,激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope, CLSM)作為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究?jī)x器中的新星之一,以其更高的圖像清晰度,更強(qiáng)的指標(biāo)觀察靈敏度,以及更客觀、精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)采集技術(shù)而愈來愈多地被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究中。由此,本課題采用免疫熒光雙標(biāo)記法同時(shí)對(duì)MAPK家族三條信號(hào)通路相關(guān)因子p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK進(jìn)行兩兩標(biāo)記,通過在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察電針干預(yù)對(duì)腦缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)MAPK家族三條信號(hào)通路的變化情況,進(jìn)一步探討電針治療腦缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。目的通過觀察電針對(duì)腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺損情況、局灶性腦梗死體積以及其腦內(nèi)MAPK家族三條信號(hào)通路(ERK信號(hào)通路/JNK信號(hào)通路/p38MAPK信號(hào)通路)中相關(guān)蛋白(p-ERK/p-JNK/p-p38MAPK)的表達(dá)情況的影響,進(jìn)一步探討電針治療腦缺血再灌注損傷的可能機(jī)制,為臨床上電針治療缺血性腦卒中提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：150只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham group)、模型組(IR group)和電針組(EA group),每組又分為2h(小時(shí))、6h(小時(shí))、1d(天)、3d(天)、7d(天)5個(gè)時(shí)間亞組,共15小組,每亞組10只。2.模型制備：本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型是腦缺血再灌注大鼠,參照Zea Longa的方法,采用改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。術(shù)前禁食12h,不禁水,具體造模方法如下：大鼠以10%水合氯醛(0.35m1/100g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉。仰臥位固定,剃去頸部毛發(fā),碘伏棉球消毒皮膚備用。于左側(cè)頸前正中線0.3cm處作2cm左右的縱形切口,用止血鉗沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離皮下筋膜、肌肉及甲狀腺等,暴露出左側(cè)頸三角,分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。在CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA,然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。在距CCA分叉部3mm處剪一小口,將栓線(預(yù)先蘸有肝素鈉)插入到ICA,這時(shí)用繞在CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢拴線。當(dāng)栓線遇到動(dòng)脈夾阻擋后,去除暫時(shí)阻斷ICA血流的動(dòng)脈夾,用眼科鑷輕推栓線,調(diào)整進(jìn)線角度,并輕輕牽拉頸總動(dòng)脈,使栓線進(jìn)入大腦,從血管分叉處開始算距離,當(dāng)插入深度在1.8±0.5cm并有輕微阻力時(shí)停止,栓線經(jīng)ICA分叉輕插入顱內(nèi)至大腦前動(dòng)脈(ACA),該深度恰好堵塞大腦中動(dòng)脈(MCA)開口,然后緊緊系牢CCA遠(yuǎn)心端的細(xì)線。缺血30mmin后進(jìn)行再灌注,將栓線頭端拉出約1 cm至頸CCA,剪掉多余栓線。將手術(shù)后的大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)觀察。假手術(shù)組操作與上述步驟相同,只進(jìn)行到暴露分離左側(cè)頸三角,不行栓線栓塞,然后縫合皮膚切口,用碘伏棉球進(jìn)行傷口消毒,單籠飼養(yǎng)觀察。3.電針治療方法：造模成功后,按照不同的分組分別施以相對(duì)應(yīng)的處理。電針組大鼠造模成功后在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)行電針治療,選穴為“尺澤與合谷”,“足三里與三陰交”,電針波型選擇疏密波,刺激頻率為5-10Hz,電壓約3-5V,以大鼠穴位周圍組織輕微抖動(dòng)為度,每次電針治療時(shí)間為20 min。2h、6h、1d亞組只進(jìn)行一次治療,3d組每日行電針治療,共計(jì)3次,7d組每日行電針治療,共7次。在每天電針的同一時(shí)間同時(shí)抓取模型組和假手術(shù)組的大鼠進(jìn)行固定,但不進(jìn)行電針干預(yù)。4.觀察指標(biāo)：各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況、腦梗死體積以及MAPK家族三條信號(hào)通路的三種相關(guān)蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK的表達(dá)水平。5.數(shù)據(jù)處理：用SPSS20.0上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)、LSD檢驗(yàn),當(dāng)P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.神經(jīng)功能缺損評(píng)分：假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)上的表現(xiàn)均未見異常,即,神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分。模型組和電針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的異常行為學(xué)表現(xiàn),神經(jīng)功能缺損評(píng)分在2-3分,兩組各時(shí)間段與假手術(shù)組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明腦缺血再灌注大鼠模型制備成功。其中,模型組2h亞組、電針組2h亞組與假手術(shù)組相比較,差異顯著(P0.01)。電針組與模型組比較,2h、6h、7d時(shí)兩組神經(jīng)功能缺損評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),1d、3d時(shí),兩組評(píng)分有顯著性差異(P0.01)。提示電針能減輕腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能損傷程度,早期干預(yù)即產(chǎn)生作用,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),治療效果愈明顯,3d時(shí)改善情況最佳,隨后以較穩(wěn)定的狀態(tài)保持。2.腦梗死體積：從TTC染色后采集到的圖像和數(shù)據(jù)分析得出,假手術(shù)組大鼠腦組織染色均勻一致,而模型組和電針組大鼠腦組織在不同時(shí)間段出現(xiàn)不同程度的梗死灶。與模型組比較,電針組6h亞組腦梗死體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),1d、3d、7d亞組腦梗體積差異較顯著(P0.01),說明電針治療可以縮小缺血再灌注后腦梗死體積。3. p-ERK、p-p38MAPK的表達(dá)情況：假手術(shù)組各時(shí)間亞組p-ERK、 p38MAPK均有少量表達(dá),各時(shí)間亞組間表達(dá)水平無差異(P0.05)。模型組、電針組與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。模型組p-ERK、 p38MAPK兩種指標(biāo)在腦缺血再灌注2h時(shí)表達(dá)均有升高趨勢(shì),模型組p-ERK在6h迅速到達(dá)峰值后逐漸回落；p-p38MAPK在1d、3d時(shí)間點(diǎn)顯示表達(dá)明顯增多(P0.01)。與模型組比較,腦缺血再灌注2h時(shí),電針組即出現(xiàn)p-ERK表達(dá)的上調(diào)(P0.05),1d、3d時(shí)間亞組上調(diào)明顯,差異顯著(P0.01)。電針組p-p38MAPK的表達(dá)水平與模型組相比較均有所下降,電針治療過程中p.p38MAPK表達(dá)抑制現(xiàn)象在3d時(shí)間亞組較明顯(P0.01)。4. p-JNK、p-p38MAPK的表達(dá)情況：電針可同時(shí)抑制p-JNK、p-p38MAPK的表達(dá)。各組各時(shí)間段p-p38MAPK的表達(dá)趨勢(shì)大致同前片。p-JNK在假手術(shù)組大鼠腦組織中亦可見少量表達(dá),但各時(shí)間亞組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與假手術(shù)組相比較,造模成功后的模型組和電針組,p-JNK陽性表達(dá)均有所升高,p-JNK約1d時(shí)達(dá)到峰值后出現(xiàn)回落。與模型組比較,腦缺血再灌注2h時(shí),電針組即出現(xiàn)p-JNK表達(dá)的下降(P0.05),電針組p-JNK的表達(dá)水平較同時(shí)段模型組均有所下降,6h、7d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；1d、3d亞組下降顯著(P0.01)。5. p-ERK、p-JNK的表達(dá)情況：假手術(shù)組各時(shí)間亞組p-ERK, p-JNK均有少量表達(dá),各時(shí)間亞組間表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。模型組、電針組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。模型組p-ERK在2h即出現(xiàn)上調(diào),在6h迅速到達(dá)峰值后逐漸回落；p-JNK約在1d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最多。與模型組比較,腦缺血再灌注2h時(shí),電針組即出現(xiàn)p-ERK表達(dá)的上調(diào)(P0.05)以及p-JNK表達(dá)的下調(diào)(P0.05),其中1d、3d時(shí)間亞組p-ERK上調(diào)明顯,差異顯著(P0.01)。而p-JNK的下調(diào)6h、7d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；1d、3d亞組下降顯著(P0.01)。結(jié)論1.電針能縮小大鼠缺血再灌注后腦梗死體積,減輕缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷程度,提示電針能在一定程度上改善缺血再灌注引起的腦組織損傷。2.電針促進(jìn)缺血再灌注引起的腦組織損傷修復(fù),發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制可能是良性綜合調(diào)控MAPK家族信號(hào)通路的表達(dá),即“針刺刺激一良性調(diào)節(jié)MAPK家族各信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá).拮抗細(xì)胞凋亡.發(fā)揮腦保護(hù)作用”。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R245

【參考文獻(xiàn)】

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1 王s，

本文編號(hào)：1378482