本文關(guān)鍵詞：鎮(zhèn)靜藥咪達唑侖對鼠膠質(zhì)細胞激活及阿片耐受的影響和機制研究　出處：《華北理工大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的阿片類鎮(zhèn)痛藥物是手術(shù)麻醉及中重度疼痛治療的首選,但其存在致痛覺過敏、耐藥性和成癮性的副作用。這些副作用的產(chǎn)生被證明由腦內(nèi)膠質(zhì)細胞激活后釋放的過量炎癥因子等介導(dǎo)。阿片藥物通過與神經(jīng)元細胞表面的阿片μ受體和κ受體結(jié)合發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,而以往研究認為阿片藥物對膠質(zhì)細胞的激活及膠質(zhì)細胞對阿片耐受的產(chǎn)生是由μ受體介導(dǎo)的。不同阿片類藥對膠質(zhì)細胞的激活作用及機制尚有待于進一步闡明。此外,已有研究表明多種炎癥性和退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都有膠質(zhì)細胞的激活及胞內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白(Translocator protein,TSPO)的高表達,而應(yīng)用TSPO配體可抑制膠質(zhì)細胞的激活。但TSPO是否參與阿片藥物對膠質(zhì)細胞的激活及使之產(chǎn)生阿片耐受過程尚不明。本研究旨在1分析不同阿片藥物對小膠質(zhì)細胞激活的影響,并闡明這一過程是否有κ受體參與;2研究TSPO是否參與阿片藥物對膠質(zhì)細胞的激活及膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的阿片耐受,以及作為TSPO配體的苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥咪達唑侖是否可以緩解阿片類鎮(zhèn)痛藥對膠質(zhì)細胞激活及阿片耐受副作用的產(chǎn)生。本研究通細胞及動物模型水平的研究為臨床麻醉聯(lián)合用藥提供更為科學(xué)合理的方案和基礎(chǔ)依據(jù)。方法1分析對阿片μ和κ受體都激活的阿片類藥物對小鼠小膠質(zhì)細胞系BV2細胞的激活效果。經(jīng)培養(yǎng)基分別給予BV2細胞等效臨床劑量的嗎啡5μM,羥考酮5μM,嗎啡酮1μM,芬太尼0.03μM,舒芬太尼0.003μM,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取各組總RNA,RT-q PCR法檢測炎性細胞因子TNF-α(Tumor necrosis factor α,腫瘤壞死因子 α)、IL-6(Interleukin-6,白介素-6)、IL-1β(Interleukin-1β,白介素-1β)的m RNA水平。2分析阿片受體部分激動劑地佐辛(激動κ受體的同時卻拮抗μ受體)對BV2細胞的激活效果,并分析非選擇性阿片受體拮抗劑納洛酮(同時拮抗μ和κ受體)對地佐辛的拮抗作用。經(jīng)培養(yǎng)基分別給予BV2細胞不同濃度的地佐辛(4μM,40μM,400μM);不同濃度的納洛酮(0.1μM,1μM,10μM);地佐辛+納洛酮(4μM+0.1μM,40μM+1μM,400μM+10μM);孵育24 h后,提取各組總RNA,RT-q PCR法檢測各組TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA水平。3經(jīng)培養(yǎng)基分別給予BV2細胞不同濃度(1μM,5μM,25μM,100μM)的嗎啡處理24 h,以及經(jīng)培養(yǎng)基分別給予嗎啡25μM孵育不同時間(6 h,12 h,24 h,48 h,72 h)后,提取各組總RNA,RT-q PCR法檢測各組TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA水平。4分析咪達唑侖對嗎啡激活BV2細胞的影響。經(jīng)培養(yǎng)基別給予BV2細胞咪達唑侖5μM、嗎啡25μM、咪達唑侖5μM+嗎啡25μM,處理24 h后提取各組總RNA,RT-q PCR法檢測各組TNF-α、IL-6、IL-1β、TSPO的m RNA水平;提取各組總蛋白,Western blot法檢測小膠質(zhì)細胞激活標記物Iba1(Ion calcium adaptor protein 1,離子鈣接頭蛋白1)和TSPO的蛋白水平。5用TSPO si RNA轉(zhuǎn)染BV2細胞24 h后,分別給予咪達唑侖5μM、嗎啡25μM、咪達唑侖5μM+嗎啡25μM,處理24 h后RT-q PCR法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA水平;Western blot檢測Iba1的蛋白水平。6嗎啡急慢性耐受大鼠模型均取正常雄性SD大鼠四組每組6只,分別給予嗎啡10 mg/kg、咪達唑侖0.5 mg/kg、咪達唑侖0.5 mg/kg+嗎啡10 mg/kg及等體積生理鹽水。大鼠急性耐受模型每兩小時給藥一次,共7次,大鼠慢性模型于每日給藥兩次,共7 d。每次給藥15 min后用熱甩尾法檢測各組大鼠疼痛閾值變化。急慢性模型均于次晨第8次給藥后處死并取中腦組織,RT-q PCR法檢測TSPO的m RNA水平,免疫組化觀察中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)Iba1、TSPO和GFAP(glial fibrillary acidic protein,膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白)的蛋白表達變化。結(jié)果1等效臨床劑量的嗎啡、羥考酮、嗎啡酮、芬太尼及舒芬太尼均可以上調(diào)BV2細胞中TNF-α、IL-6及IL-1β的m RNA水平(P0.05)。2 10倍臨床劑量的地佐辛可以引起B(yǎng)V2細胞TNF-α、IL-6及IL-1βm RNA水平上調(diào)(P0.05),納洛酮單獨給藥對BV2細胞TNF-α、IL-6及IL-1βm RNA水平無影響(P0.05)。但納洛酮可以抑制地佐辛對對BV2細胞TNF-α、IL-6及IL-1βm RNA的上調(diào)作用(P0.05)。3嗎啡對BV2細胞TNF-α、IL-6及IL-1β的m RNA的上調(diào)作用呈時間和劑量依賴性。4等效臨床劑量咪達唑侖對BV2細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β及TSPO表達均無影響(P0.05)。但與嗎啡組相比,咪達唑侖和嗎啡聯(lián)合用藥組中TNF-α、IL-6、IL-1β及TSPO的m RNA水平顯著下調(diào)(P0.05),TSPO及Iba1的蛋白水平顯著下調(diào)(P0.05)。5敲低TSPO后,嗎啡對小膠質(zhì)細胞的激活作用未受影響,而咪達唑侖和嗎啡聯(lián)合用藥組中TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA及Iba1蛋白水平顯著低于嗎啡組(P0.05)。6嗎啡急性耐受模型在第五次注藥后,咪達唑侖明顯抑制了多次注射嗎啡導(dǎo)致的痛閾下降(P0.05);咪達唑侖顯著抑制了(P0.05)嗎啡對TSPO m RNA的上調(diào)作用(P0.05);免疫組化顯示,咪達唑侖明顯抑制(P0.05)嗎啡引起的Iba1和TSPO蛋白水平的上調(diào)(P0.05)。嗎啡慢性耐受模型在第4天給藥后,咪達唑侖明顯抑制了多次注射嗎啡導(dǎo)致的痛閾下降(P0.05);咪達唑侖顯著抑制了(P0.05)嗎啡對TSPO m RNA的上調(diào)作用(P0.05);免疫組化顯示,咪達唑明顯抑制了(P0.05)嗎啡引起的GFAP和TSPO蛋白水平的上調(diào)(P0.05)。結(jié)論1等效臨床劑量的阿片藥物能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞激活并促進炎性因子表達。2阿片藥物激活小膠質(zhì)細胞不僅有μ受體介導(dǎo),κ受體也參與其中。3嗎啡對小膠質(zhì)細胞的激活呈時間和劑量依賴。4咪達唑侖本身不引起小膠質(zhì)細胞變化,但卻可以抑制嗎啡引起的小膠質(zhì)細胞激活,并下調(diào)TSPO的表達。5 TSPO不介導(dǎo)嗎啡對小膠質(zhì)細胞的激活過程,但它是介導(dǎo)咪達唑侖抑制嗎啡對小膠質(zhì)細胞激活作用的因素之一。6體內(nèi)實驗同樣證實,咪達唑侖同嗎啡聯(lián)合給藥抑制了急慢性嗎啡耐受模型大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活,抑制TSPO的表達的上調(diào),并延遲熱痛耐受的時間。
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本文編號：1360040