本文關鍵詞：帕金森大鼠模型的神經(jīng)干細胞移植治療實驗研究

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【摘要】：[目的]帕金森病是神經(jīng)科學領域研究的焦點,一直以來,科學工作者花費大量時間潛心研究帕金森病的發(fā)病機制、治療手段,相關進展在不斷跟新。本文主要通過體內(nèi)實驗來研究神經(jīng)干細胞移植對帕金森病大鼠的治療作用,及移植微環(huán)境的探討,為臨床應用提供理論依據(jù)。[方法]1.神經(jīng)于細胞(NSCs)分離、培養(yǎng)、鑒定：取懷孕14-15天的SD胎鼠,顯微鏡下分離中腦,經(jīng)胰蛋白酶消化分離制成細胞懸液,加入B27、EGF、bFGF經(jīng)計數(shù)、調(diào)整細胞濃度后無血清培養(yǎng)。Nestin細胞免疫化學鑒定神經(jīng)干細胞后按時半量換液培養(yǎng)備用。2.NSCs分化培養(yǎng)后,免疫細胞化學(TH、β-3-Tubli、GFAP)鑒定細胞分化情況。3.帕金森病大鼠模型建立,依照大鼠George Paxinos and Charles Watson圖譜(第六版),選取260-280g(279±16.7)雄性SD大鼠,2%戊巴比妥鈉(0.6ml/100g)腹腔注射麻醉,麻醉成功后于大鼠腦立體定向儀正確固定,切開頭皮,保持前囟后囟在同一水平。以右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束MFB(Medial Forebrain Bundle):(A/P：-3.6mm：L：+2.0 mm：V：-9.0 mm)：腹側(cè)被蓋區(qū)VTA(Ventral Tegmental Area):(A/P:-6.0 mm：L：+0.5 mm；V：-8.0 mm)；尾殼核CPu (Caudate Putamen, Striatum):(A/P：+1.2mmm；L：+2.5mm：V：-5.0)作為立體定向注射靶點,向靶點進針注入4μ16-OHDA(3μg/μl),以1μl/min緩慢注入,注射完畢停留微量進樣器6min,最后再緩慢退出針頭。術后7d,開始誘導大鼠向左側(cè)旋轉(zhuǎn),腹腔注射APO(0.5mg/kg)10分鐘后開始記錄旋轉(zhuǎn)圈數(shù),每只計時5mmin,以后每7d一次,連續(xù)測試6次。以向左側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于或等于7圈/min的大鼠作為PD建模成功的大鼠。4.神經(jīng)干細胞移植,31只PD建模成功的大鼠隨機分為2組,最后納入統(tǒng)計12只/組(除去后續(xù)試驗死亡)：①對照組(等體積PBS),②mNSCs移植組：移植前以1200轉(zhuǎn)/分離心收集細胞,以106/ul細胞密度注射。細胞準備好后,PD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.6ml/100g)麻醉,待麻醉成功,固定于立體定向儀,于右側(cè)紋狀體(A/P：+0.6 mm；L：+3.0 mm;V：-5.0 mm)用微量注射器注入51μl細胞懸液。分別在14天、28天、42天細胞移植后不同的時間點腹腔注射APO(0.5 mg/kg)誘導大鼠旋轉(zhuǎn)。5.移植后14d、28d、42d,麻醉大鼠后行腦組織取材,進行WB,PCR,免疫組織熒光染色檢測多巴胺能神經(jīng)元相關基因、蛋白表達情況。6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理：SPSS 17.0作統(tǒng)計處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±S)表示,統(tǒng)計學檢驗方法用配對t檢驗,單因素方差分析(one-way AVONA), P0.05無統(tǒng)計學差異；P0.05存在統(tǒng)計學意義；P0.001存在顯著統(tǒng)計學差異。[結(jié)果]1.體外細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示：神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程中球狀懸浮生長,部分貼壁生長,Nestin鑒定陽性,分化培養(yǎng)后形成大量細胞間連接,TH、β-3-Tublin、GFAP鑒定陽性。2.動物模型誘導結(jié)果：1周vs 2周：P=0.6650.05；2周vs 3周：P=0.0470.05；3周vs 4周P=0.0030.05；4周分別與1/2周比較P0.001;5周分別與1/2/3/4周比較P0.001；6周分別與1/2/3/4/5周比較P0.001。神經(jīng)干細胞移植后：(1)對照組；2周vs 4周：P=0.0030.05；6周分別與2/4周：P0.001；(2)神經(jīng)干細胞移植組：2周vs 4周：P=0.0110.05；2周vs 6周：P0.001；4周vs 6周：P=0.1770.05。(3)神經(jīng)干細胞移植組2周vs對照組2/4/6周：P0.001；神經(jīng)干細胞移植4周vs對照組2/4/6周：P0.001；神經(jīng)干細胞移植組6周vs對照組2/4/6周：P0.001。3.免疫組織熒光陽性細胞計數(shù)檢測可看到神經(jīng)干細胞移植組較對照組陽性細胞數(shù)有顯著差異,隨時間推移細胞數(shù)目呈減少趨勢。Nestin計數(shù)結(jié)果：2/4/6周vs對照組P0.001。TH計數(shù)結(jié)果：移植組各時間點與對照組比較P0.001；移植6周vs移植2周P=0.0030.05。VMAT2計數(shù)結(jié)果：2/4/6周vs對照組P0.001；移植6周vs移植2周P=0.1580.05。DAT計數(shù)結(jié)果：對照組vs移植2周P=0.0150.05,其余相互比較P0.001。Pitx3計數(shù)結(jié)果：對照組與移植2周P0.001。Lmx1a計數(shù)結(jié)果：對照組vs移植4周P0.001,移植組在移植4周較2/6周均有差異。神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元比例約占7%-24%左右。4.Western Blot檢測到神經(jīng)干細胞組較對照組TH蛋白表達增加(P0.001)。對照組各時間點比較P0.001,蛋白表達量隨時間延長逐漸降低；神經(jīng)干細胞移植組4周vs對照組各時間點P0.001；神經(jīng)干細胞各時間點比較P0.001。5.PCR神經(jīng)干細胞移植4周vs其余各時間點P0.001,存在顯著統(tǒng)計學差異；對照組之間比較P值均0.05,不存在統(tǒng)計學意義。[結(jié)論]神經(jīng)干細胞移植能夠在一定程度上改善帕金森病大鼠行為學,移植的神經(jīng)干細胞能夠分化,定植,遷移,但是分化為多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量較少,尚不能穩(wěn)定有效的遠期存活,任面臨諸多挑戰(zhàn)。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5;R-332

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