發(fā)布時間：2017-11-07 20:28

  本文關鍵詞：大鼠骨折愈合過程中神經(jīng)肽SP、NYP及其受體NK1、NPYR1表達關系的初步研究

  更多相關文章： 大鼠 股骨骨折模型 外固定架 神脛肽Y 神經(jīng)肽Y受體 P物質 P物質受體

【摘要】：近年來,骨科技術和器械有了長足的發(fā)展,很多新的技術與成果面世,但創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨不愈合等一直是困擾骨科醫(yī)生和威脅人類生命健康的醫(yī)學難題。明確骨的形成、重建、塑形的病理生理學特點及其生物學機制,對于從根本上提高其治療效果而言是基礎和出發(fā)點。骨組織為一種帶有神經(jīng)支配、血管伴行的復雜的生物活性組織,能根據(jù)需要進行自我修復。骨折修復的過程涉及機體細胞因子、體液、多種組織之間錯綜復雜的協(xié)同作用,與血液供應、神經(jīng)支配密切相關,充足的血液供應是保證骨組織愈合的先決條件；而完善的神經(jīng)支配起到協(xié)調與反饋作用,保證其修復區(qū)域內環(huán)境的生物學穩(wěn)定。血液供應的重建在骨及移植物保持生物學活性的重要作用已被國內外眾多研究者探討并證實,此外,骨組織再生過程中神經(jīng)因素同樣發(fā)揮著非常重要的作用。與血管因素相比,神經(jīng)因素如何影響骨折愈合、骨再生及其在骨代謝中的具體作用機制仍遠未明確。有學者進行關于神經(jīng)因素對于骨折愈合、骨重建調節(jié)作用的研究中,已表明人長管狀骨中有感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)纖維存在,這些神經(jīng)纖維與骨的重塑和生長有關；1960年,Gibson首次報道合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的股骨骨折的病人,其骨折處有較多的骨癡形成,在骨癡的量以及骨癡的形成速度方面均比單純股骨骨折患者多和快。此外,國外研究也證實神經(jīng)因素對骨修復、骨折愈合具有調節(jié)作用。這些研究與實踐結果證實神經(jīng)因素在骨代謝中起著重要的生物調節(jié)作用。已有研究結果表明骨組織中的神經(jīng)纖維主要為肽能神經(jīng)。骨組織營養(yǎng)和代謝狀況主要是通過肽能神經(jīng)分泌的神經(jīng)肽來介導實現(xiàn),這些肽能神經(jīng)大多與血管伴行,有少數(shù)游離神經(jīng)末梢伸出并止于骨膜襯里細胞層、骨髓細胞團等,其作用的靶細胞為成骨細胞和破骨細胞。神經(jīng)肽是機體各種組織生成的具有神經(jīng)調節(jié)活性的肽類物質,具有廣泛的生物學效應,其中,NPY是最具代表性的物質。SP和CGRP是感覺神經(jīng)纖維分泌的兩種主要神經(jīng)肽；NPY由自主神經(jīng)分泌。其中CGRP已有大量研究結果,作用及機制已基本明確。而對于SP、NPY的研究相對較少。神經(jīng)肽SP屬于一種可由骨骼感覺神經(jīng)元分泌的速激肽,由11個氨基酸組成。在骨生理調節(jié)中起著重要作用,3種SP受體分別為NK1受體、NK2受體、NK3受體,神經(jīng)肽SP在許多生理過程中的調節(jié)作用是通過NK1受體發(fā)揮作用。NPY主要由大腦弓狀核合成,其陽性神經(jīng)纖維廣泛分布于骨髓、骺端、骨膜等代謝活躍區(qū),在血管周圍也可以觀察到NPY陽性纖維的包繞。NPY通過作用于五種Y受體(Y1,Y2,Y4,Y5和Y6)發(fā)揮其生物學作用,這五種受體均屬于G蛋白偶聯(lián)受體。其中Y1、Y2受體與成骨細胞的誘導分化、增殖等密切相關,近年也有研究結果表明Y4也參與骨代謝。本課題組前期研究結果表明骨髓基質干細胞(BMSC s)表達CGRP、SP、NPY受體,并且細胞實驗證實外源性添加神經(jīng)肽能通過其相關受體促進BMSC向成骨細胞方向增殖、分化,國外相關研究也表明成骨細胞上表達神經(jīng)肽受體,以及神經(jīng)肽參與骨折修復,骨代謝。那么隨之可以發(fā)現(xiàn)一些問題,在骨折愈合過程神經(jīng)肽與骨折愈合各階段的分泌是否有量效關系,在骨折斷端集中表達于哪些部位?這些都未見相關文獻報道。而研究骨折愈合過程中神經(jīng)肽的分泌需要有合適的動物骨折模型,大鼠因飼養(yǎng)條件簡單,投入成本低,養(yǎng)殖周期短,其基因明確并可通過基因修飾來確定某些基因在骨折愈合過程中的分子機制,并且大量的單克隆抗體可用于大鼠,相比大動物投入的實驗成本低,周期短等優(yōu)勢而受到科研工作者的青睞。限制大鼠用于動物骨折模型研究的主要因素是缺乏穩(wěn)定的固定裝置。目前,實驗用于大鼠骨折固定的器械有髓內針、髓內加壓螺釘、帶鎖髓內釘、微型鋼板系統(tǒng)、外固定架等。其對大鼠骨折的固定方式各有優(yōu)劣。髓內針雖操作簡單,但其固定穩(wěn)定性差,無抗旋轉穩(wěn)定性與抗軸向穩(wěn)定性。帶鎖髓內釘和鎖定鋼板雖然克服了旋轉和軸向不穩(wěn)定的缺點,但其破壞髓內外血運系統(tǒng),可能影響骨折愈合機制的研究,微型鋼板系統(tǒng)通過骨折表面兩斷端固定,對局部骨折斷端愈合可能會產(chǎn)生影響,以至增加實驗偏倚。外固定架是本實驗研究較理想的骨折固定器械,通過四根克氏針固定骨折兩斷端,骨折端完全不受植入物的影響,且固定穩(wěn)定,抗旋轉穩(wěn)定性與抗軸向穩(wěn)定性好。因此本研究以大鼠為實驗對象,通過制作大鼠股骨骨折模型,自制外固定架固定大鼠股骨兩斷端,并觀察其骨折愈合情況,通過X線、Micro-CT、組織學染色檢測相關成骨指標評價大鼠骨折模型的重復性及可靠性,骨折模型標準統(tǒng)一、穩(wěn)定并且重復可靠后大量制作大鼠股骨骨折模型,骨折愈合過程各時間點取材,用Q-pcr、免疫組化檢測神經(jīng)肽SP、NPY及其受體的基因、蛋白表達,觀察其在骨折愈合過程中各時間點表達情況。本實驗為神經(jīng)肽相關動物實驗提供一定的實驗基礎及依據(jù),同時也為臨床應用治療骨折以及骨代謝疾病提供新的思路和理論基礎。研究目的1.建立一種可靠的,可重復的大鼠股骨骨折模型2.初步探討神經(jīng)肽S P、NPY及其受體NK1、NPYR1與骨折愈合各時間點的關系第一部分大鼠股骨骨折模型的建立實驗目的：建立一種簡單的,可靠的,可重復的大鼠骨折模型.實驗方法：1.外固定架的設計與制作：外固定架參照臨床實踐中應用的單邊外固定架而進行設計。外固定架由鈦合金材料的主架、外側夾針塊、四根不銹鋼自攻螺紋克氏針組成(由天津新中器械公司制作提供)。外固定架可通過調節(jié)中心螺紋桿進行外固定架的延長與短縮。自攻螺紋克氏針直徑為1.2mm。2.大鼠股骨動物模型的建立：選擇健康成年雄性SD大鼠12只,體重在480～550 g之間,所有動物購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。手術過程：充分麻醉后,肌注抗生素預防感染,術野區(qū)剃毛,采用左側臥位,酒精紗布消毒,鋪單,沿右下肢外側切開皮膚,分離前外側和后側肌間隔,充分暴露股骨,在股骨兩端分別擰入兩顆螺紋克氏針,在克氏針上安裝主架固定股骨,用帶鋸片的微型小電鋸于股骨中段緩慢截骨,生理鹽水沖洗截骨端,截骨完成后沖洗創(chuàng)面,徹底止血后逐層關閉切口。手術過程均在嚴格無菌條件下進行。術后再次肌注抗生素,酒精紗布包繞外固定架,將動物放回籠中自由進食喂養(yǎng)。3.術后大體觀察：術后觀察傷口愈合情況、步態(tài)、活動能力、飲食狀況、有無針道感染、以及外固定架有無松動。4.術后拍攝大腿側位X片觀察骨折斷端的對位及骨痂生長情況,micro-CT掃描和定量評估骨折區(qū)域的BV/TV值,組織學染色觀察成骨情況。實驗結果：1.實驗動物一般情況：實驗選用12只SD大鼠全部存活,并進入實驗結果分析。大體觀察：所有動物術后切口全部愈合,無感染,術后外固定架固定良好,無松動及退針等現(xiàn)象。動物健康狀態(tài)良好,外固定架未對動物產(chǎn)生不良影響。X線顯示術后骨折斷端對位良好,骨痂逐漸增多。Micro-CT結果：四周BV/TV為(49±4)%,八周BV/TV為(61±6)%(p0.05)。2.組織學觀察結果：4周骨折端有部分骨痂相連,Masson染色示可見新骨生成；8周骨折斷端已橋接,骨髓腔開始相通,外周骨痂減少,Masson染色示新生骨漸趨向成熟。結論：自制微型外固定架能提供大鼠股骨骨折良好的穩(wěn)定性,本實驗提供了一個簡單、可靠、可重復的骨折模型。第二部分初步探討神經(jīng)肽SP、NPY及其受體在大鼠骨折愈合過程的表達情況實驗目的：初步探討神經(jīng)肽SP、NPY及其受體NK1、NPYR1與骨折愈合各時間點的關系實驗方法：1.建立實驗動物模型：選擇健康成年雄性SD大鼠55只,體重在480-550g之間。骨折模型建立過程同第一部分。2.分別于術后2、4、6、8、12周各處死8只大鼠和3只正常大鼠,取右側股骨中段,行HE、Masson染色,X線、Micro-CT評價骨折愈合情況,同時行免疫組化染色檢測骨折斷端SP、NPY、NK1及NPYR1的表達分布情況,并提取骨折斷端組織總RNA行Real-time PCR檢測SP、NPY、NK1及NPYR1的轉錄情況。實驗結果：1.X線：術后2周骨折端模糊,4周骨折端已有連續(xù)骨痂通過,但仍可見骨折線,6周骨折基本愈合,8周骨髓腔基本已相通,12周骨折愈合并完成重塑。2.HE染色和Masson染色：2周時切片上可見骨折斷端；4周骨折端成軟骨痂相連；6周骨折基本愈合,Masson染色示斷端新生骨較多；8周骨折端骨髓腔開始相通,外周骨痂減少,Masson染色示新生骨質呈藍紅相間,表明新生骨折正逐漸成熟；12周骨髓腔完全相通,骨折基本愈合。3.免疫組化染色：術后免疫組化染色示SP、NK1、NPY在骨折斷端的成骨細胞,成軟骨細胞周圍,新生血管、新生骨周圍及骨膜下均有表達,術后4周、6周陽性表達量多,隨時間推移8周和12周陽性表達量逐漸減少。NPYR1免疫組化染色示術后2、4周在骨折斷端的成骨細胞,成軟骨細胞,及骨膜下均有少量表達,術后6周在成骨細胞周圍,骨膜下,新生血管和新生骨周圍有大量表達,隨著時間推移8周和12周表達量逐漸減少。4. Real-time PCR檢測SP、NPY、NK1及NPYR1轉錄情況：術后2周Real-time PCR檢測SP、NPY、NK1呈高轉錄,4周達到高峰,于6、8、12周表達量逐漸下降,在12周表達最低。NPYR1轉錄在術后2周及4周稍有升高,在6周達到高峰,于8周、12周轉錄水平逐漸下降,但都高于術后2周、4周的轉錄及正常骨組織的基因轉錄。結論：神經(jīng)肽S P、NP Y及其各自受體在骨折愈合過程中表達均高于正常骨組織,SP、NK1在骨折炎癥反應期及骨痂形成期表達量顯著增多,并且兩者的表達趨勢大致相同,提示SP可能通過NK1神經(jīng)肽在骨折早中期促進骨折愈合,而在骨折愈合晚期神經(jīng)肽SP、NK1的mRNA轉錄和表達高于正常骨組織,提示SP和NK1在骨痂的重塑階段可能也發(fā)揮作用；NPY在骨折愈合早中期表達量升高,提示其可能通過相應受體促進骨折愈合,而NPYR1在早期轉錄和表達均不明顯,提示NPY在骨折愈合早期可能不通過NPYR1受體調節(jié)骨的生成；NPYR1在骨折早期呈低表達,而在骨折中晚期表達升高,提示NPYR1可能與骨折愈合中晚期骨痂重塑有關。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R683

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1 孟憲周;調控攝食的神經(jīng)肽及其機制研究進展[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志;2004年13期

2 蘇偉青;余澤琪;沈如暉;李樹裕;寧曉明;黃德良;;丹參對慢性肺源性心臟病患者血漿神經(jīng)降壓素及神經(jīng)肽Y含量的影響[J];廣東醫(yī)學院學報;2006年02期

3 徐國濤;白俊偉;曹桂霞;;神經(jīng)肽Y的記憶調節(jié)作用與運動[J];中國臨床康復;2006年26期

4 崔風華;;神經(jīng)肽Y與妊娠高血壓綜合征[J];齊魯醫(yī)學雜志;2006年04期

5 許光蘭;;肺心病患者神經(jīng)降壓素、神經(jīng)肽Y的變化及其意義[J];廣西醫(yī)學;2006年10期

6 Coiro V.;Chiodera P;Melani A. ;黨慧敏;;女性運動員血漿中神經(jīng)肽Y濃度與月經(jīng)周期[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(婦產(chǎn)科學分冊);2006年09期

7 陳立剛;遲寶榮;孫艷;;神經(jīng)肽Y的臨床研究進展[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2007年02期

8 范艷萍;石建華;項平;;神經(jīng)肽Y結構和作用[J];實用全科醫(yī)學;2007年06期

9 廖曉琴;;神經(jīng)肽B的研究進展[J];保健醫(yī)學研究與實踐;2007年03期

10 王晉;李晨軍;;原發(fā)性三叉神經(jīng)痛與神經(jīng)肽的相關研究進展[J];西南國防醫(yī)藥;2010年08期

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1 耿珊珊;曲丹;何芳;林寧;;中鏈甘油三酯飲食對神經(jīng)肽Y及瘦素的作用研究[A];膳食變遷對民眾健康的影響：挑戰(zhàn)與應對——第二屆兩岸四地營養(yǎng)改善學術會議學術報告及論文摘要匯編[C];2010年

2 朱麗萍;黃萃;徐麗珍;徐玉萍;呂莉君;;針刺結合藥物治療對腦梗死患者血漿神經(jīng)肽Y的影響[A];浙江省第十屆核醫(yī)學與放射醫(yī)學防護學術會議論文匯編[C];2007年

3 劉維英;余勤;張佳賓;岳紅梅;;神經(jīng)肽Y與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的關系[A];中華醫(yī)學會呼吸病學年會——2011（第十二次全國呼吸病學學術會議）論文匯編[C];2011年

4 侯玉晶;雷治海;蘇娟;李月勤;姚遠;楊桂紅;;兔神經(jīng)肽S及其受體的基因克隆及組織表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十六次學術研討會論文集[C];2010年

5 朱維莉;史海水;陸林;;神經(jīng)肽三葉因子3的抗抑郁作用及其機制研究[A];第十一屆全國青年藥學工作者最新科研成果交流會論文集[C];2012年

6 路長林;崔瑞躍;祝元祥;劉真;林葆城;朱年;;三種神經(jīng)肽對大鼠學習和記憶的影響[A];全國第六屆心理學學術會議文摘選集[C];1987年

7 余玉林;周德里;查塔基;簡榮村;;瘦素輿神經(jīng)肽Y對大鼠腦垂體促甲狀腺激素基因轉錄之調控研究[A];中國生理學會肥胖的臨床與基礎暨神經(jīng)免疫內分泌學術研討會論文摘要匯編[C];2003年

8 耿珊珊;蔡東聯(lián);曲丹;馮曉慧;金迪;鄭慧;林寧;;中鏈甘油三酯飲食對神經(jīng)肽Y及瘦素的作用研究[A];中華醫(yī)學會第十一屆全國營養(yǎng)支持學術會議論文匯編[C];2008年

9 黃俊生;傅小霞;;神經(jīng)肽AST1基因串聯(lián)體的構建與表達[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機遇、責任和對策（下冊）[C];2002年

10 姚遠;雷治海;蘇娟;楊桂紅;;神經(jīng)肽S對豬免疫調節(jié)的研究[A];中國解剖學會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

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1 袁建秋;癲癇疾病通過神經(jīng)肽修復可獲新生[N];科技日報;2013年

2 編譯 王金元;神奇生物開關控制人體胖瘦[N];北京科技報;2007年

3 ;紅亮瘦素源[N];中國畜牧報;2004年

4 張?zhí)锟?找出恐懼的生物根源[N];大眾科技報;2009年

5 張超群 范曉莉;神經(jīng)肽P物質可輔助移植肌蒂生長[N];中國醫(yī)藥報;2005年

6 胥曉琦;兩位科學家的跨世紀之爭[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

7 記者 任海軍;一種特殊基因變異可能導致早期冠心病[N];新華每日電訊;2009年

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9 曾凡新 董志 傅潔民;新靶點研究促進減肥新藥開發(fā)[N];中國醫(yī)藥報;2006年

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1 段開鵬;胰島素通過下丘腦IKKβ/NF-κB-P0MC神經(jīng)肽通路調節(jié)膿毒癥機體高分解代謝的研究[D];南京大學;2015年

2 廖原;人神經(jīng)肽S受體結構功能和信號轉導機制研究[D];浙江大學;2016年

3 鄧曉燕;家蠶神經(jīng)肽受體NPFR信號轉導和內吞分子機制的研究[D];浙江大學;2012年

4 韓仁文;神經(jīng)肽S對記憶、結腸運動和攝食的調節(jié)作用[D];蘭州大學;2009年

5 甘玲;家蠶腦組織基因表達譜和神經(jīng)肽及肽樣基因的功能研究[D];西南大學;2011年

6 邵玉峰;神經(jīng)肽S對小鼠嗅覺的調控[D];蘭州大學;2014年

7 趙正卿;神經(jīng)肽S在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達及其對睡眠/覺醒和認知功能影響的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

8 鮑嵐;神經(jīng)肽Y的Y_1受體在心臟和血管中的定位及在模擬失重大鼠腦動脈中的分布[D];第四軍醫(yī)大學;1999年

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1 王明明;中樞微量注射神經(jīng)肽W對下丘腦室旁核區(qū)氨基酸含量的影響[D];延邊大學;2015年

2 房蕊;豬神經(jīng)肽W及其受體的基因克隆、分布定位以及在母豬發(fā)情周期中生殖軸的表達變化[D];南京農業(yè)大學;2014年

3 寇振媛;情志因素對不同年齡組心房顫動患者血清中神經(jīng)肽Y與心鈉素的影響[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2015年

4 李婧;神經(jīng)肽S通過其受體抗alarm pheromones引起的小鼠焦慮樣行為[D];蘭州大學;2014年

5 董朝玉;神經(jīng)肽S改善過敏性鼻炎引起的焦慮樣行為[D];蘭州大學;2014年

6 藺洋春;多腸目渦蟲神經(jīng)肽Myomodulin和FMRFamide的免疫組化定位及對肌細胞電位活動影響的研究[D];魯東大學;2016年

7 何豐;基于J2EE的神經(jīng)肽數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)的設計與實現(xiàn)[D];華中科技大學;2014年

8 皮迪;基于PubMed摘要的神經(jīng)肽信息提取系統(tǒng)的設計與實現(xiàn)[D];華中科技大學;2014年

9 劉松;神經(jīng)肽Y對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化調控效應及其經(jīng)典Wnt信號通路相關性研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

10 唐強;神經(jīng)肽數(shù)據(jù)庫構建及其前體預測[D];電子科技大學;2016年

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本文編號：1153992