本文關(guān)鍵詞：次氯酸修飾白蛋白對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟線粒體功能及腎間質(zhì)纖維化的影響

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【摘要】：研究背景腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis. RIF)是各種腎臟疾病最終進(jìn)展至終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的共同途徑和主要病理基礎(chǔ),其主要特征為腎小管周圍毛細(xì)血管消失,腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤,肌成纖維細(xì)胞激活,細(xì)胞外基質(zhì)(如膠原、纖維粘連蛋白等)在間質(zhì)中的沉積。腎間質(zhì)纖維化涉及免疫炎癥反應(yīng)、腎臟固有細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、成纖維細(xì)胞增殖及活化、上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化等過程,其中,氧化應(yīng)激在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化防御之間嚴(yán)重失衡。越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激反應(yīng)參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。Sedeek指出,在病理狀態(tài)下如慢性腎臟病,組織中的過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)會導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激的發(fā)生,氧化應(yīng)激激活進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥及腎纖維化的發(fā)生。線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的最主要部位,也是氧化應(yīng)激損傷的首要靶細(xì)胞器。線粒體氧化損傷誘導(dǎo)的線粒體功能障礙會導(dǎo)致疾病的發(fā)生與進(jìn)展。目前已經(jīng)證實(shí)線粒體氧化應(yīng)激損傷及線粒體功能障礙與腫瘤、衰老、帕金森病、阿爾茨海默病、缺血缺氧性腦損傷、脂肪性肝病、糖尿病,膿毒性休克、心肌缺血再灌注損傷等多種疾病密切相關(guān)。線粒體功能失常導(dǎo)致ATP消耗、ROS過度產(chǎn)生和細(xì)胞色素C (Cyto C)和線粒體DNA等促凋亡因子的釋放,通過DNA和蛋白的氧化應(yīng)激(OS)損傷和促凋亡反應(yīng),繼之出現(xiàn)炎癥和纖維化。腎臟是高能量代謝器官,線粒體含量豐富,線粒體功能失常在腎間質(zhì)纖維化中可能起關(guān)鍵作用,近年受到越來越多的關(guān)注。Granata等研究者發(fā)現(xiàn),在2-3期CKD患者人群中,線粒體呼吸鏈系統(tǒng)存在異常,線粒體功能受損的主要原因是因?yàn)槁阅I臟病患者體內(nèi)存在過度的氧化應(yīng)激。有研究表明線粒體功能障礙在慢性腎功能衰竭大鼠模型中參與腎臟纖維化的發(fā)展,吡非尼酮和過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)均能夠減輕腎臟氧化應(yīng)激水平,抑制線粒體功能障礙并進(jìn)一步減輕腎臟纖維化。研究證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目與腎間質(zhì)纖維化的程度呈密切正相關(guān),能夠干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的藥物亦能抑制巨噬細(xì)胞浸潤和腎小管間質(zhì)的纖維化。以上證據(jù)表明,線粒體氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的線粒體功能障礙以及腎小管上皮細(xì)胞調(diào)亡與腎纖維化存在密切關(guān)系,針對線粒體氧化應(yīng)激損傷進(jìn)行靶向抗氧化治療成為腎纖維化治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。次氯酸修飾白蛋白(Hypochlorite-modified albumin, HOCl-alb)是體內(nèi)蛋白氧化的標(biāo)志物,還是一種強(qiáng)的促氧化應(yīng)激、促炎癥反應(yīng)介質(zhì),與動(dòng)脈粥樣硬化損傷、糖尿病腎病、慢性腎臟病等多種疾病進(jìn)展密切相關(guān)。在大鼠慢性腎衰模型中,HOCl-alb可加速慢性腎衰大鼠尿蛋白排泄,降低肌酐清除率,通過氧化還原敏感的炎癥通路加速腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。然而,HOCl-alb作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)因子,它能否誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激損傷,促使腎臟線粒體功能障礙,進(jìn)一步促使腎小管上皮細(xì)胞調(diào)亡加速腎間質(zhì)纖維化,目前尚無報(bào)道。SS肽是由4個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽,它含有一個(gè)特殊序列結(jié)構(gòu)域,使其能夠靶向作用于線粒體而不依賴線粒體膜電位,使其在線粒體內(nèi)濃度達(dá)到細(xì)胞外的1000-10000倍。SS肽高濃度積聚于線粒體內(nèi)膜,減少線粒體ROS產(chǎn)生并清除已產(chǎn)生的ROS,發(fā)揮高效抗氧化作用,防止Cyto C等凋亡因子釋放到細(xì)胞漿,對線粒體氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。目前,SS肽已經(jīng)在缺血性腦損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變、阿爾茨海默病等動(dòng)物模型中發(fā)揮出其高效的抗氧化作用。但其對腎間質(zhì)纖維化是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制目前尚不十分清楚。單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)是一種成熟的研究凋亡和纖維化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１狙芯恳源笫髥蝹?cè)輸尿管結(jié)扎為腎間質(zhì)纖維化模型,旨在驗(yàn)證我們提出的假說：HOC1-alb誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激損傷,促使線粒體功能障礙,促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步加速腎間質(zhì)纖維化,SS肽可能減輕HOC1-alb所致的腎臟線粒體氧化損傷,從而起到了保護(hù)腎臟的作用。研究方法一、無內(nèi)毒素HOC1修飾的大鼠血清白蛋白(HOC1-RSA)的制備和鑒定：將純化的無內(nèi)毒素大鼠血清白蛋白(RSA)溶液與HOC1 (200mmol/L)按照1：140摩爾比混合,室溫避光孵育30分鐘。制備的HOC1-RSA裝入透析袋,在4℃無菌PBS溶液中透析24小時(shí),每隔4-6小時(shí)換一次新配制的無菌PBS溶液,以去除游離的次氯酸。透析結(jié)束后,用除菌濾器過濾除菌,應(yīng)用內(nèi)毒素去除膠柱去除內(nèi)毒素。配制過程中所有玻璃器皿均經(jīng)180℃烘烤4小時(shí)去內(nèi)毒素處理。利用鱟試驗(yàn)法內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測制備的HOC1-RSA內(nèi)毒素水平,并證實(shí)內(nèi)毒素水平低于0.025 Eu/m1。體外制備的HOC1-RSA濃度為5.3±0.4 nmol/mg蛋白質(zhì),對照樣本的HOC1-RSA含量為0.2±0.03 nmol/mg蛋白質(zhì)。二、SS肽的合成和進(jìn)入線粒體的鑒定1.SS肽的合成SS肽由杭州中肽公司協(xié)助合成,SS肽氨基酸序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)各個(gè)SS肽氨基酸序列如下：SS-02 (Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2',6'-dimethyltyrosine), SS-31 (D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)。2.線粒體提取取腎組織(皮質(zhì))100mg,按照試劑盒說明書提取線粒體。3.SS肽體外進(jìn)入線粒體的鑒定用固相法合成SS-02 (Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2',6'-dimethyltyrosine),用[3H]標(biāo)記SS-02,采用液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行在線粒體中定位的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果顯示,SS-02分布于線粒體外膜約20-30%,線粒體內(nèi)膜約50%,線粒體基質(zhì)20-30%。三、動(dòng)物模型建立和分組1.單側(cè)輸尿管梗阻模型(UUO)建立：雄性SD大鼠(購自xx實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),初始體重180-220 g,在恒溫清潔環(huán)境(南方醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,以3%戊巴比妥鈉0.15 ml/kg腹腔麻醉,仰臥位固定于手術(shù)臺上,剪毛后常規(guī)碘酒酒精消毒,行腹中線切口(切口長度3-4 cm左右),逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層,鹽水紗布把腸包到旁邊,暴露左腎,向下探尋左側(cè)髂血管(左輸尿管跨過左髂總動(dòng)脈),尋找到左輸尿管并游離,分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用4-0號絲線結(jié)扎,在兩結(jié)扎點(diǎn)之間切斷輸尿管防止逆行性感染,逐層縫合關(guān)腹。假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。手術(shù)過程注意無菌操作原則。2.動(dòng)物分組(1)假手術(shù)對照組：假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷；(2)UUO大鼠+生理鹽水注射組：尾靜脈注射同UUO大鼠+RSA注射組及UUO大鼠+HOC1-RSA注射組等體積的生理鹽水：1次/日；(3)UUO大鼠+RSA注射組：尾靜脈注射未經(jīng)修飾的正常大鼠白蛋白：RSA100 mg/kg,1次/日；(4)UUO大鼠+HOC1-RSA注射組：尾靜脈注射次氯酸修飾的大鼠白蛋白(HOC1-RSA):HOC1-RSA 100 mg/kg,1次/日；(5)UUO大鼠+HOC1-RSA+SS-31干預(yù)組：尾靜脈注射HOC1-RSA 100 mg/kg,1次/日；同時(shí)給予SS-31 3mg/kg腹腔注射1次/日。四、標(biāo)本留取和指標(biāo)檢測：于分組后第14天麻醉處死動(dòng)物,留取腎組織標(biāo)本,進(jìn)行后續(xù)檢測。1.線粒體損傷指標(biāo)檢測：(1)電鏡觀察腎皮質(zhì)線粒體超微結(jié)構(gòu)；(2)差速離心法提取腎皮質(zhì)線粒體,采用JC-1染色法結(jié)合熒光酶標(biāo)儀檢測線粒體膜電位；(3)差速離心法提取腎皮質(zhì)線粒體,采用熒光探針DCFDA染料法結(jié)合熒光酶標(biāo)儀測定線粒體內(nèi)ROS;(4)提取腎皮質(zhì)總DNA,應(yīng)用real-time PCR測定線粒體mtDNA的拷貝數(shù)；(5)利用“熒光素酶-熒光素體系”檢測腎組織三磷酸腺苷(ATP)。2.氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：(1)腎皮質(zhì)勻漿的HOC1-alb濃度檢測：以不同濃度氯胺T制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定酸性條件下340 nm處吸光值；(2)采用TBA顯色法檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應(yīng)活性物質(zhì)(TBARS);(3)采用WST-8法檢測腎勻漿錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力。3.凋亡指標(biāo)檢測：(1)原位末端標(biāo)記法(TUNEL)法檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡及計(jì)數(shù)；(2)應(yīng)用Western blotting檢測腎組織cleaved caspase-3/7/9、PARP-1 (89kd)、線粒體及胞漿細(xì)胞色素C；4.纖維化指標(biāo)檢測：(1)腎臟病理觀察：腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片,行Masson染色,顯微鏡觀察腎間質(zhì)纖維化病變程度并拍照；(2) Western blot、real-time PCR及免疫組化檢測Collagen-I、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)、 Fibronectin。五、統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0完成。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA,組間兩兩比較方差齊采用LSD法,方差不齊采用Dunnett's T3檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、HOC1-alb對線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響1.注射HOC1-RSA對UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)的影響電鏡結(jié)果顯示：與假手術(shù)相比,其他四組UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體均出現(xiàn)不同程度的形態(tài)腫脹,灶性空化,嵴模糊不清甚至消失(P0.05), HOC1-RSA注射進(jìn)一步加重UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體病變(P0.05),SS-31治療可減輕注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)線粒體病變程度加重(P0.05)。2.注射HOC1-RSA加重UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體功能障礙(1)注射HOC1-RSA降低UUO大鼠腎皮質(zhì)膜電位與假手術(shù)相比,其他四組UUO大鼠腎臟線粒體膜電位均顯著降低(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步降低UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體膜電位(P0.05),SS-31可改善因注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎臟線粒體膜電位下降(P0.05)。(2)注射HOC1-RSA增加UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體ROS產(chǎn)生與假手術(shù)組相比,其他四組UUO大鼠腎小管線粒體產(chǎn)生的ROS均顯著升高(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步增加了UUO大鼠腎小管線粒體ROS產(chǎn)生(P0.05),SS-31可降低注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)線粒體ROS水平增高(P0.05)。(3)注射HOC1-RSA降低UUO大鼠腎皮質(zhì)組織ATP產(chǎn)生與假手術(shù)組相比,其他四組UUO大鼠腎皮質(zhì)組織ATP含量均顯著降低(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步降低了UUO大鼠腎皮質(zhì)ATP含量(P0.05),SS-31可升高注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)ATP含量降低(P0.05)。(4)注射HOC1-RSA降低UUO大鼠腎皮質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)與假手術(shù)組相比,其他四組UUO大鼠腎皮質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)均顯著降低(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步降低了UUO大鼠腎皮質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)(P0.05),SS-31可改善注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)的降低(P0.05)。二、HOCl-alb對大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響1.與假手術(shù)組相比,其他四組UUO大鼠腎組織勻漿HOCl-alb水平均顯著增高(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步增加了UUO大鼠腎組織勻漿HOCl-alb水平,SS-31治療可降低注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎組織勻漿HOCl-alb水平升高(P0.05)。2.與假手術(shù)組相比,其他四組UUO大鼠腎組織勻漿TBARS水平均顯著增高(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步增加了UUO大鼠腎組織勻漿TBARS, SS-31治療可降低注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎組織勻漿TBARS水平的升高(P0.05)。3.與假手術(shù)組相比,其他四組UUO大鼠腎組織勻漿Mn-SOD活力均降低(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步降低了UUO大鼠腎組織勻漿Mn-SOD活力(P0.05),SS-31治療可改善注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎組織勻漿Mn-SOD活力降低(P0.05)。三、HOCl-alb對腎小管上皮細(xì)胞調(diào)亡的影響1.與假手術(shù)相比,其他四組UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯增多(P0.05),且注射HOC1-RSA可進(jìn)一步增加UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目(P0.05),而SS-31治療可抑制因注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡增多(P0.05)。2.Western結(jié)果顯示：與假手術(shù)相比,其他四組UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體內(nèi)CytoC蛋白水平均顯著降低(P0.05),胞漿CytoC蛋白水平均顯著增高(P0.05)；注射HOC1-RSA可加劇UUO大鼠腎皮質(zhì)CytoC由線粒體向胞漿轉(zhuǎn)移(P0.05),SS-31治療可阻止因注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)CytoC由線粒體向胞漿轉(zhuǎn)移(P0.05)。3.與假手術(shù)相比,其他四組UUO大鼠腎皮質(zhì)cleaved caspase-3、 cleaved caspase-7、cleaved caspase-9、cleaved PARP-1表達(dá)均增多(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步促使UUO大鼠腎腎組織cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、 cleaved caspase-9、cleaved PARP-1表達(dá)(P0.05),而SS-31治療可抑制因注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的大鼠腎皮質(zhì)cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、 cleaved caspase-9、cleaved PARP-1表達(dá)增加(P0.05)。四、HOC1-alb對腎間質(zhì)纖維化的影響1.MASSON結(jié)果顯示：假手術(shù)組未見明顯異常,其他四組UUO大鼠腎臟均出現(xiàn)不同程度膠原沉積,HOC1-RSA注射進(jìn)一步加重UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化程度,SS-31治療可減輕因注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的腎間質(zhì)膠原沉積增多。2.Westemblot與Real-time PCR結(jié)果均顯示：與假手術(shù)相比,其他四組UUO大鼠腎臟Collagen-I 、 Fibronectin、 α-SMA水平均顯著增高(P0.05),注射HOC1-RSA進(jìn)一步增加UUO大鼠Collagen-I 、Fibronectn、 α-SMA表達(dá)(P0.05),SS-31治療可改善注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起纖維化加劇(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎組織Collagen-I Fibronectin、 α-SMA在腎血管平滑肌附近少量表達(dá),而腎間質(zhì)中表達(dá)極少,與假手術(shù)組相比,Collagen-I、 Fibronectin、 α-SMA均在其他四組UUO大鼠腎間質(zhì)不同程度的沉積,其中注射HOC1-RSA進(jìn)一步增加了Collagen-I、 Fibronectin、α-SMA在UUO大鼠腎間質(zhì)的表達(dá),SS-31治療可抑制注射HOC1-RSA及UUO手術(shù)引起的大鼠腎組織Collagen-I、Fibronectin、 α-SMA表達(dá)的增加。免疫組化結(jié)果與real-time PCR及Western-blot結(jié)果一致。結(jié)論一、UUO大鼠腎組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯增加、線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損、腎間質(zhì)細(xì)胞凋亡和腎間質(zhì)纖維化；二、HOC1-alb是已知的促氧化應(yīng)激介質(zhì),反復(fù)注射加重UUO大鼠的上述病理生物學(xué)效應(yīng)；SS-31靶向作用于線粒體減輕了UUO大鼠以及HOC1-alb誘導(dǎo)加重的上述病理生物學(xué)效應(yīng)。提示UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化、腎間質(zhì)病變進(jìn)展是由于線粒體氧化應(yīng)激損傷所致；線粒體氧化應(yīng)激損傷和功能失常,是腎間質(zhì)纖維化新的干預(yù)靶點(diǎn)；線粒體靶向抗氧化劑SS-31未來可能成為抑制腎間質(zhì)纖維化和腎臟保護(hù)的新藥,改善慢性腎臟病預(yù)后。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R693.2

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本文編號：1139524