本文關(guān)鍵詞：白介素-36α在自身免疫性心肌炎小鼠中的促炎作用

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【摘要】：研究背景：心肌炎(myocarditis)是一種心肌炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為心肌細胞壞死和間質(zhì)炎性細胞浸潤,一般誘因有感染、自身免疫、中毒等,常累及心肌細胞、間質(zhì)及心臟瓣膜、心包,最終導致整個心臟結(jié)構(gòu)受損。因其復(fù)雜的發(fā)病機制,臨床上表現(xiàn)為不同程度的胸悶、氣促、氣喘、心臟衰竭、猝死等多種癥狀。在一些沒有臨床癥狀的年輕人當中發(fā)病率也在逐年升高,他們的總數(shù)占40歲以下猝死病例的12%。盡管恢復(fù)健康對這些年輕的患者來說還算是比較容易,但是也存在一些遺傳易感性的年輕患病者會隨著時間的拖延慢慢的進展為慢性心肌炎和擴張型心肌病(DCM),而且有些患者到最后還可能出現(xiàn)急性充血性心臟衰竭的反復(fù)發(fā)作。雖然心肌炎的概念表面上看上去很簡單,但是其診斷和治療仍然是臨床面臨的重大難題。病毒性心肌炎(Viral myocarditis, VMC)是一臨床常見心血管系統(tǒng)疾病。是由病毒感染引起心肌細胞的變性、壞死、間質(zhì)炎癥細胞浸潤及纖維滲出為主要病理改變的疾病。自從1899年Fiedler KL報道了3例病理概念的VMC后,歐美各國關(guān)于VMC的報道也越來越多。20世紀70年代,中國及日本等亞洲國家也相繼報道了VMC相關(guān)病例,近年來隨著VMC的發(fā)病逐年上升,VMC己成為我國青少年不明原因猝死的主要原因之一。急性VMC患者常無自覺癥狀或者只是輕微的感冒癥狀,機體可自行清除病毒而痊愈。10-20%的患者可發(fā)展為慢VMC、充血性心衰甚至擴張型心肌病,不僅如此,慢性VMC也�？蓪е聰U張型心臟病的發(fā)生,美國調(diào)查顯示每年新增擴張型心臟病病人多達100,000人,是心臟移植手術(shù)量增加的重要原因之一。眾所周知VMC嚴重危害著人們的生命健康,然而迄今為止,由于VMC的發(fā)病機制還不完全清楚,對VMC的治療尚無有效的辦法,它涉及病毒的直接損傷、免疫機制、生化機制、心肌纖維化、細胞凋亡等,目前多數(shù)研究認為病毒觸發(fā)的心肌自身免疫反應(yīng)(即自身免疫性心肌炎(Autoimmune myocarditis, AMC)是VMC進行性心肌損傷的主要原因。如何有效減輕這種免疫反應(yīng)損傷,成為VMC治療亟待解決的熱點問題。因此,闡明VMC的發(fā)病機制具有重要的理論和實踐意義。臨床上關(guān)于病毒性心肌炎的治療,主要以靜脈注射丙種球蛋白調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)等減輕心肌損害和傳統(tǒng)的改善心肌能量代謝等方式,均無明確而有效的治療方式。近年來國內(nèi)外很多專家也進行了各種嘗試,從不同的角度開展了大量針對治療該病藥物的實驗研究,如共刺激分子的基因靶向治療或抑制炎癥因子、調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)藥物、調(diào)節(jié)Th1/Th2炎癥因子的分泌藥物、抑制心肌重構(gòu)藥物的探索與開發(fā)等,試圖在治療方面有所突破。隨著對細胞因子研究的不斷深入,越來越多的專家將治療心肌炎的目光聚集在了應(yīng)用細胞因子治療上,而且這種方法也獲得了一定的研究成果。目前已應(yīng)用到臨床的細胞因子有重組白介素-2,重組干擾素等。IL-36是最近才被命名的IL-1家族新成員,由3個生物學功能相似的分子IL-36α、IL-36β及IL-36 Y組成,IL-36Ra是其天然拮抗劑。IL-36成員的共同受體為IL-36R,可與IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)相結(jié)合形成二聚體。細胞外IL-36不跨膜蛋白IL-36R及IL-1RAcP的胞外結(jié)構(gòu)結(jié)合后形成復(fù)合物,通過胞內(nèi)區(qū)功能域與接頭蛋白髓樣分化蛋白88 (myeloid differentiation primary response 88, MyD88)結(jié)合,活化MAPKs、NF-κB信號級聯(lián)途徑,發(fā)揮促炎、活化免疫反應(yīng)的作用。研究顯示,IL-36成員免疫調(diào)理及免疫激活作用較傳統(tǒng)IL-1家族成員更強,是樹突細胞和T細胞的強效調(diào)節(jié)劑,參與樹突細胞與Th細胞的激活、抗原提呈和刺激促炎因子產(chǎn)生,在免疫反應(yīng)中具有巨大的潛能。主要表現(xiàn)在①對免疫細胞的作用：在體外,小鼠的骨髓來源樹突樣細胞(BMDC)和CD4+T細胞能對IL-36產(chǎn)生明顯的特異性反應(yīng),IL-36激活CD4+T細胞中Th1細胞反應(yīng)；在體內(nèi),IL-36能促進樹突細胞的成熟,上調(diào)樹突細胞表面MHC-II和共刺激分子CD80/CD86的表達,增強樹突細胞抗原提呈功能,并刺激Th0細胞向Thl細胞分化。Nicklin等研究表明,在促進抗原提呈方面樹突細胞對IL-36的反應(yīng)比對IL-1更強烈。Thl和Th2細胞表達IL-36R mRNA水平較IL-1高。②對細胞因子的作用：鼠骨髓源性樹突細胞(BMDCs)和CD4+T細胞持續(xù)性表達IL-36R,當受到IL-36刺激,BMDCs產(chǎn)生促炎癥性細胞因子如IL-12、IL-18、 IL-6、TNF-γ、IL-23等,CD4+T細胞產(chǎn)生INF-γ、IL-4、IL-17等,這些應(yīng)答反應(yīng)均可被IL-36Ra所拮抗。目前IL-36和自身免疫病之間的關(guān)系,在心血管系統(tǒng)尚未見報道。心肌a-肌球蛋白重鏈的肽段誘導的實驗性自身免疫性心肌(Experimental autoimmune myocarditis , EAM)動物模型主要用于研究自身免疫機制在心肌炎發(fā)病及進展過程中的作用。該模型主要通過人為誘發(fā)靶向心肌的自身免疫而致病,因其剔除了其他復(fù)雜感染因素的影響,可專門用于自身免疫機制致病的研究,為研究心臟特異性免疫反應(yīng)和心肌炎癥損害提供了極好的實驗動物模型。本研究通過皮下注射心肌α-肌球蛋白重鏈短肽免疫BALB/c小鼠誘導AMC,將實驗小鼠在造模第15天,分別予IL-36α和IL-36Ra連續(xù)腹腔注射7天,于第21天行小鼠心臟超聲檢查,酶聯(lián)免疫吸附法測定血清炎癥因子IL-23、IL-17濃度；蘇木精-伊紅(HE)染色檢查心肌病理改變。觀察IL-36 α對小鼠AMC模型免疫反應(yīng)的作用,旨在探討IL-36 α在AMC發(fā)病機制中的作用,為AMC的防治提供新思路。第一章AMC過程中IL-36 a與心肌損傷程度呈正相關(guān)目的：選用BALB/c小鼠構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎(AMC)動物模型,明確AMC時IL-36α表達上調(diào)與心肌免疫損傷之間的關(guān)系。方法：1.野生型雄性BALB/c小鼠(六周齡),體重14-18g之間,購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心(SPF級環(huán)境下飼養(yǎng))。所有實驗動物操作流程均獲得實驗動物保護權(quán)威機構(gòu)的批準,并遵循南方醫(yī)科大學動物實驗指導準則。2.AMC動物模型的構(gòu)建將24只BALB/c小鼠隨機分成4組,其中包括：正常對照組(C組)；低劑量短肽組(L組)；中劑量短肽組(M組)；高劑量短肽組(H組)。其中后3組小鼠共18只于不同時間先后2次用特異的短肽免疫構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型,該特異的短肽為小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-(MyHc-a614-629[Ac-S LKLM ATLFSTYAS AD-OH])。計劃在實驗第0天和第7天時每一只實驗小鼠采用背部皮下注射的方式分別注射準備好的含有短肽的乳化劑共2次。接種后觀察大鼠的活動、飲食、毛色及體重變化。分別于首次接種免疫劑后的第14天、21天到B超功能檢查室給小鼠做心臟超聲檢察、采用Western blot檢測心肌IL-36 α蛋白表達、給實驗小鼠心臟組織切取的標本做蘇木素-伊紅染色及顯微鏡下觀察并計數(shù)后完成病理學評分。結(jié)果：在自身免疫性心肌炎的實驗動物模型中,用小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-衍生的肽和免疫的弗氏完全佐劑乳化的BALB/c小鼠中誘導的心肌炎,IL-36α在普通小鼠心肌有低水平表達,而在AMC小鼠模型中IL-36 α表達明顯增多；并且隨著IL-36 α表達增多,心肌炎損傷程度也加重。結(jié)論：1.應(yīng)用小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-衍生的肽免疫BALB/c小鼠可成功的建立EAM模型。2.AMC過程中IL-36α與心肌損傷程度呈正相關(guān)第二章IL-36 a促進AMC小鼠心功能惡化目的：探討白介素-36 α在自身免疫性心肌炎(autoimmune myocardioptis, AMC)小鼠中的促炎作用。方法：1.將40只BALB/c小鼠隨機分為對照組(Ctrl組)、AMC組、AMC+IL-36 a組和AMC+IL-36Ra組。取200μg肌球蛋白重鏈短肽免疫小鼠建AMC模型,在小鼠建模第15天,后兩組分別接受IL-36 α和IL-36Ra(0.1ug/只/d)連續(xù)7天腹腔注射,對照組與AMC組小鼠僅接受等劑量生理鹽水腹腔注射。于實驗第21天檢查小鼠各項指標。2.經(jīng)胸心臟超聲檢查：將這些小鼠先麻醉,測量完每只小鼠體重后,經(jīng)胸做超聲心動圖檢測,分別測量收縮末期和舒張末期左室內(nèi)徑,通過儀器計算自動獲取左室內(nèi)射血分數(shù)和左室短軸縮短率。3.蘇木精-伊紅(HE)染色檢查心肌病理改變：安樂死所有實驗小鼠,將心臟標本浸泡在福爾馬林中24小時,后經(jīng)石蠟包理、切片,行蘇木素和伊紅染色。4.酶聯(lián)免疫吸附法測定血清IL-23、IL-17濃度：酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測各組小鼠血清中的白介素-23(IL-23)和白介素-17(IL-17)水平。結(jié)果：成功建立小鼠AMC模型后,與Ctrl組相比,實驗組小鼠出現(xiàn)不同程度的心功能不全,血清IL-23、IL-17水平均明顯增高,心肌病理切片可見炎癥細胞浸潤,其中又以AMC+IL-36 a組小鼠炎癥因子上升、炎癥細胞浸潤增加及心功能不全最明顯,而較AMC組,AMC+IL-36Ra組小鼠的各項指標被顯著抑制。結(jié)論：1.AMC過程前加入外源性重組IL-36 α,免疫應(yīng)答增強,加重心肌損傷。2.AMC過程中加入IL-36RA阻斷IL-36 α,可抑制免疫應(yīng)答,減輕心肌損傷。全文總結(jié)：1.通過皮下注射心肌α-肌球蛋白重鏈短肽免疫BALB/c小鼠可成功誘導AMC。2.IL-36α的表達上調(diào)可加重AMC小鼠心肌炎癥損傷程度。3.IL-36 α作為促炎因子在AMC自身免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,它通過促進T細胞增殖及細胞因子分泌的作用,直接參與心肌炎病程,抑制IL-36 α的表達可減輕心肌免疫反應(yīng),抑制AMC的進展。
【關(guān)鍵詞】：白介素-36α 白介素-36Ra 自身免疫性心肌炎 小鼠
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.21
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 第一章 IL-36α在自身免疫性心肌炎過程中的表達及與心肌損傷程度關(guān)系研究25-40
• 1. 實驗材料與方法26-35
• 2. 實驗結(jié)果35-38
• 3. 討論38-39
• 結(jié)論39-40
• 第二章 IL-36α促進AMC小鼠心功能惡化40-55
• 1. 材料與方法44-50
• 2. 實驗結(jié)果50-52
• 3 討論52-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻56-64
• 中英文縮略詞對照表64-65
• 攻讀學位期間成果65-66
• 致謝66-68

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭曉辰;張軍平;朱亞萍;劉虹;;病毒性心肌炎患者臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后因素的隨訪研究[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭曉辰;張軍平;朱亞萍;劉虹;;病毒性心肌炎患者臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后因素的隨訪研究[A];第五屆全國中醫(yī)藥博士生優(yōu)秀論文專輯[C];2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 高夢莎;外源性IL-17對病毒性心肌炎小鼠淋巴細胞及巨噬細胞分泌細胞因子的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

2 黃明山;非諾貝特通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子的平衡改善自身免疫性心肌炎[D];福建醫(yī)科大學;2013年

3 賴文盈;IL-17A基因敲除對病毒性心肌炎小鼠抗心肌抗體的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2014年

4 林聯(lián)韻;Th17/Treg細胞在病毒性心肌炎中的作用[D];福建醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：1135432