本文關(guān)鍵詞：白介素-36α在自身免疫性心肌炎小鼠中的促炎作用

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【摘要】：研究背景：心肌炎(myocarditis)是一種心肌炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),一般誘因有感染、自身免疫、中毒等,常累及心肌細(xì)胞、間質(zhì)及心臟瓣膜、心包,最終導(dǎo)致整個(gè)心臟結(jié)構(gòu)受損。因其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,臨床上表現(xiàn)為不同程度的胸悶、氣促、氣喘、心臟衰竭、猝死等多種癥狀。在一些沒(méi)有臨床癥狀的年輕人當(dāng)中發(fā)病率也在逐年升高,他們的總數(shù)占40歲以下猝死病例的12%。盡管恢復(fù)健康對(duì)這些年輕的患者來(lái)說(shuō)還算是比較容易,但是也存在一些遺傳易感性的年輕患病者會(huì)隨著時(shí)間的拖延慢慢的進(jìn)展為慢性心肌炎和擴(kuò)張型心肌病(DCM),而且有些患者到最后還可能出現(xiàn)急性充血性心臟衰竭的反復(fù)發(fā)作。雖然心肌炎的概念表面上看上去很簡(jiǎn)單,但是其診斷和治療仍然是臨床面臨的重大難題。病毒性心肌炎(Viral myocarditis, VMC)是一臨床常見(jiàn)心血管系統(tǒng)疾病。是由病毒感染引起心肌細(xì)胞的變性、壞死、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維滲出為主要病理改變的疾病。自從1899年Fiedler KL報(bào)道了3例病理概念的VMC后,歐美各國(guó)關(guān)于VMC的報(bào)道也越來(lái)越多。20世紀(jì)70年代,中國(guó)及日本等亞洲國(guó)家也相繼報(bào)道了VMC相關(guān)病例,近年來(lái)隨著VMC的發(fā)病逐年上升,VMC己成為我國(guó)青少年不明原因猝死的主要原因之一。急性VMC患者常無(wú)自覺(jué)癥狀或者只是輕微的感冒癥狀,機(jī)體可自行清除病毒而痊愈。10-20%的患者可發(fā)展為慢VMC、充血性心衰甚至擴(kuò)張型心肌病,不僅如此,慢性VMC也�？蓪�(dǎo)致擴(kuò)張型心臟病的發(fā)生,美國(guó)調(diào)查顯示每年新增擴(kuò)張型心臟病病人多達(dá)100,000人,是心臟移植手術(shù)量增加的重要原因之一。眾所周知VMC嚴(yán)重危害著人們的生命健康,然而迄今為止,由于VMC的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚,對(duì)VMC的治療尚無(wú)有效的辦法,它涉及病毒的直接損傷、免疫機(jī)制、生化機(jī)制、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡等,目前多數(shù)研究認(rèn)為病毒觸發(fā)的心肌自身免疫反應(yīng)(即自身免疫性心肌炎(Autoimmune myocarditis, AMC)是VMC進(jìn)行性心肌損傷的主要原因。如何有效減輕這種免疫反應(yīng)損傷,成為VMC治療亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。因此,闡明VMC的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。臨床上關(guān)于病毒性心肌炎的治療,主要以靜脈注射丙種球蛋白調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)等減輕心肌損害和傳統(tǒng)的改善心肌能量代謝等方式,均無(wú)明確而有效的治療方式。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外很多專家也進(jìn)行了各種嘗試,從不同的角度開(kāi)展了大量針對(duì)治療該病藥物的實(shí)驗(yàn)研究,如共刺激分子的基因靶向治療或抑制炎癥因子、調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)藥物、調(diào)節(jié)Th1/Th2炎癥因子的分泌藥物、抑制心肌重構(gòu)藥物的探索與開(kāi)發(fā)等,試圖在治療方面有所突破。隨著對(duì)細(xì)胞因子研究的不斷深入,越來(lái)越多的專家將治療心肌炎的目光聚集在了應(yīng)用細(xì)胞因子治療上,而且這種方法也獲得了一定的研究成果。目前已應(yīng)用到臨床的細(xì)胞因子有重組白介素-2,重組干擾素等。IL-36是最近才被命名的IL-1家族新成員,由3個(gè)生物學(xué)功能相似的分子IL-36α、IL-36β及IL-36 Y組成,IL-36Ra是其天然拮抗劑。IL-36成員的共同受體為IL-36R,可與IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)相結(jié)合形成二聚體。細(xì)胞外IL-36不跨膜蛋白IL-36R及IL-1RAcP的胞外結(jié)構(gòu)結(jié)合后形成復(fù)合物,通過(guò)胞內(nèi)區(qū)功能域與接頭蛋白髓樣分化蛋白88 (myeloid differentiation primary response 88, MyD88)結(jié)合,活化MAPKs、NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑,發(fā)揮促炎、活化免疫反應(yīng)的作用。研究顯示,IL-36成員免疫調(diào)理及免疫激活作用較傳統(tǒng)IL-1家族成員更強(qiáng),是樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞的強(qiáng)效調(diào)節(jié)劑,參與樹(shù)突細(xì)胞與Th細(xì)胞的激活、抗原提呈和刺激促炎因子產(chǎn)生,在免疫反應(yīng)中具有巨大的潛能。主要表現(xiàn)在①對(duì)免疫細(xì)胞的作用：在體外,小鼠的骨髓來(lái)源樹(shù)突樣細(xì)胞(BMDC)和CD4+T細(xì)胞能對(duì)IL-36產(chǎn)生明顯的特異性反應(yīng),IL-36激活CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞反應(yīng)；在體內(nèi),IL-36能促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞的成熟,上調(diào)樹(shù)突細(xì)胞表面MHC-II和共刺激分子CD80/CD86的表達(dá),增強(qiáng)樹(shù)突細(xì)胞抗原提呈功能,并刺激Th0細(xì)胞向Thl細(xì)胞分化。Nicklin等研究表明,在促進(jìn)抗原提呈方面樹(shù)突細(xì)胞對(duì)IL-36的反應(yīng)比對(duì)IL-1更強(qiáng)烈。Thl和Th2細(xì)胞表達(dá)IL-36R mRNA水平較IL-1高。②對(duì)細(xì)胞因子的作用：鼠骨髓源性樹(shù)突細(xì)胞(BMDCs)和CD4+T細(xì)胞持續(xù)性表達(dá)IL-36R,當(dāng)受到IL-36刺激,BMDCs產(chǎn)生促炎癥性細(xì)胞因子如IL-12、IL-18、 IL-6、TNF-γ、IL-23等,CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ、IL-4、IL-17等,這些應(yīng)答反應(yīng)均可被IL-36Ra所拮抗。目前IL-36和自身免疫病之間的關(guān)系,在心血管系統(tǒng)尚未見(jiàn)報(bào)道。心肌a-肌球蛋白重鏈的肽段誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌(Experimental autoimmune myocarditis , EAM)動(dòng)物模型主要用于研究自身免疫機(jī)制在心肌炎發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程中的作用。該模型主要通過(guò)人為誘發(fā)靶向心肌的自身免疫而致病,因其剔除了其他復(fù)雜感染因素的影響,可專門用于自身免疫機(jī)制致病的研究,為研究心臟特異性免疫反應(yīng)和心肌炎癥損害提供了極好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本研究通過(guò)皮下注射心肌α-肌球蛋白重鏈短肽免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)AMC,將實(shí)驗(yàn)小鼠在造模第15天,分別予IL-36α和IL-36Ra連續(xù)腹腔注射7天,于第21天行小鼠心臟超聲檢查,酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清炎癥因子IL-23、IL-17濃度；蘇木精-伊紅(HE)染色檢查心肌病理改變。觀察IL-36 α對(duì)小鼠AMC模型免疫反應(yīng)的作用,旨在探討IL-36 α在AMC發(fā)病機(jī)制中的作用,為AMC的防治提供新思路。第一章AMC過(guò)程中IL-36 a與心肌損傷程度呈正相關(guān)目的：選用BALB/c小鼠構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(AMC)動(dòng)物模型,明確AMC時(shí)IL-36α表達(dá)上調(diào)與心肌免疫損傷之間的關(guān)系。方法：1.野生型雄性BALB/c小鼠(六周齡),體重14-18g之間,購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng))。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作流程均獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)權(quán)威機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn),并遵循南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)準(zhǔn)則。2.AMC動(dòng)物模型的構(gòu)建將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組,其中包括：正常對(duì)照組(C組)；低劑量短肽組(L組)；中劑量短肽組(M組)；高劑量短肽組(H組)。其中后3組小鼠共18只于不同時(shí)間先后2次用特異的短肽免疫構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎動(dòng)物模型,該特異的短肽為小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-(MyHc-a614-629[Ac-S LKLM ATLFSTYAS AD-OH])。計(jì)劃在實(shí)驗(yàn)第0天和第7天時(shí)每一只實(shí)驗(yàn)小鼠采用背部皮下注射的方式分別注射準(zhǔn)備好的含有短肽的乳化劑共2次。接種后觀察大鼠的活動(dòng)、飲食、毛色及體重變化。分別于首次接種免疫劑后的第14天、21天到B超功能檢查室給小鼠做心臟超聲檢察、采用Western blot檢測(cè)心肌IL-36 α蛋白表達(dá)、給實(shí)驗(yàn)小鼠心臟組織切取的標(biāo)本做蘇木素-伊紅染色及顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)后完成病理學(xué)評(píng)分。結(jié)果：在自身免疫性心肌炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中,用小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-衍生的肽和免疫的弗氏完全佐劑乳化的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的心肌炎,IL-36α在普通小鼠心肌有低水平表達(dá),而在AMC小鼠模型中IL-36 α表達(dá)明顯增多；并且隨著IL-36 α表達(dá)增多,心肌炎損傷程度也加重。結(jié)論：1.應(yīng)用小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-衍生的肽免疫BALB/c小鼠可成功的建立EAM模型。2.AMC過(guò)程中IL-36α與心肌損傷程度呈正相關(guān)第二章IL-36 a促進(jìn)AMC小鼠心功能惡化目的：探討白介素-36 α在自身免疫性心肌炎(autoimmune myocardioptis, AMC)小鼠中的促炎作用。方法：1.將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Ctrl組)、AMC組、AMC+IL-36 a組和AMC+IL-36Ra組。取200μg肌球蛋白重鏈短肽免疫小鼠建AMC模型,在小鼠建模第15天,后兩組分別接受IL-36 α和IL-36Ra(0.1ug/只/d)連續(xù)7天腹腔注射,對(duì)照組與AMC組小鼠僅接受等劑量生理鹽水腹腔注射。于實(shí)驗(yàn)第21天檢查小鼠各項(xiàng)指標(biāo)。2.經(jīng)胸心臟超聲檢查：將這些小鼠先麻醉,測(cè)量完每只小鼠體重后,經(jīng)胸做超聲心動(dòng)圖檢測(cè),分別測(cè)量收縮末期和舒張末期左室內(nèi)徑,通過(guò)儀器計(jì)算自動(dòng)獲取左室內(nèi)射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率。3.蘇木精-伊紅(HE)染色檢查心肌病理改變：安樂(lè)死所有實(shí)驗(yàn)小鼠,將心臟標(biāo)本浸泡在福爾馬林中24小時(shí),后經(jīng)石蠟包理、切片,行蘇木素和伊紅染色。4.酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清IL-23、IL-17濃度：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中的白介素-23(IL-23)和白介素-17(IL-17)水平。結(jié)果：成功建立小鼠AMC模型后,與Ctrl組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)不同程度的心功能不全,血清IL-23、IL-17水平均明顯增高,心肌病理切片可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),其中又以AMC+IL-36 a組小鼠炎癥因子上升、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加及心功能不全最明顯,而較AMC組,AMC+IL-36Ra組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)被顯著抑制。結(jié)論：1.AMC過(guò)程前加入外源性重組IL-36 α,免疫應(yīng)答增強(qiáng),加重心肌損傷。2.AMC過(guò)程中加入IL-36RA阻斷IL-36 α,可抑制免疫應(yīng)答,減輕心肌損傷。全文總結(jié)：1.通過(guò)皮下注射心肌α-肌球蛋白重鏈短肽免疫BALB/c小鼠可成功誘導(dǎo)AMC。2.IL-36α的表達(dá)上調(diào)可加重AMC小鼠心肌炎癥損傷程度。3.IL-36 α作為促炎因子在AMC自身免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,它通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌的作用,直接參與心肌炎病程,抑制IL-36 α的表達(dá)可減輕心肌免疫反應(yīng),抑制AMC的進(jìn)展。
【關(guān)鍵詞】：白介素-36α 白介素-36Ra 自身免疫性心肌炎 小鼠
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.21
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 第一章 IL-36α在自身免疫性心肌炎過(guò)程中的表達(dá)及與心肌損傷程度關(guān)系研究25-40
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與方法26-35
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-38
• 3. 討論38-39
• 結(jié)論39-40
• 第二章 IL-36α促進(jìn)AMC小鼠心功能惡化40-55
• 1. 材料與方法44-50
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-52
• 3 討論52-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-64
• 中英文縮略詞對(duì)照表64-65
• 攻讀學(xué)位期間成果65-66
• 致謝66-68

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 郭曉辰;張軍平;朱亞萍;劉虹;;病毒性心肌炎患者臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后因素的隨訪研究[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年05期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 郭曉辰;張軍平;朱亞萍;劉虹;;病毒性心肌炎患者臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后因素的隨訪研究[A];第五屆全國(guó)中醫(yī)藥博士生優(yōu)秀論文專輯[C];2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：1135432