本文關鍵詞：普魯士藍聯(lián)合血液灌流治療急性鉈中毒—特異性巰基化合物及神經(jīng)遞質(zhì)的研究

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【摘要】：目的采用高效液相色譜法(HPLC)測定急性鉈中毒犬經(jīng)不同方法治療后血漿中谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及腦組織中興奮性、抑制性氨基酸含量的變化,進一步探究體內(nèi)鉈與巰基結(jié)合,引起脂質(zhì)過氧化以及神經(jīng)毒性損害的機制,為急性鉈中毒治療提供理論依據(jù)。方法1、動物模型：24只比格犬隨機分成4組,雌雄各半(n=6),分別為染毒對照組、普魯士藍治療組(PB)、血液灌流治療組(HP)以及普魯士藍聯(lián)合血液灌流治療組(PB+HP),各組均給予硝酸亞鉈(TINO3)半數(shù)致死劑量(LD50=45mg/kg)灌胃染毒,對照組染毒后不做任何處理；PB組于首次染毒后4小時給予普魯士藍灌胃,劑量為467mg/kg/d,分3次,連續(xù)5日；HP組染毒后4小時開始進行血液灌流,每次2小時,每日1次,連續(xù)5日；PB+HP組染毒后4小時給予PB組聯(lián)合HP組的處理方式；期間觀察動物體重,精神狀態(tài),飲食情況變化,10日后處死,分離并留取不同腦區(qū)腦組織。2、高效液相色譜法測定血漿中谷胱甘肽及半胱氨酸的含量：4組動物分別進行染毒前及染毒后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192h、216 h、240 h采血1 ml,冰浴,立即離心,取上清,以青霉胺為內(nèi)標,DTNB為衍生化試劑,衍生化處理后,采用高效液相色譜—紫外(HPLC-UV)法,色譜柱為ZORBAX SB-C 18(4.6×250 nm,5 μm),流動相：A 0.05 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH=5.6)-甲醇(90：10)；B甲醇-水(90：10),甲醇梯度洗脫,流速：1 ml/min,柱溫30℃,檢測波長：320 nm,檢測血漿中谷胱甘肽和半胱氨酸的含量,剩余血漿置于-79℃,以便日后測定。3、高效液相色譜法測定腦組織中興奮性及抑制性氨基酸的含量：觀察10日后麻醉處死動物,分別取腦組織的皮質(zhì)、紋狀體、海馬、下丘腦、小腦及腦干各0.1 g,按質(zhì)量／體積之比1：10加入0.1 mol/L的高氯酸,勻漿機冰浴勻漿后加入冷凍離心機(4℃,16000 r,15min),離心后取上清液500 μl,用1 mol/L的氫氧化鈉將組織液調(diào)pH=9,定容至1ml,以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生化試劑,采用高效液相色譜—熒光(HPLC-FLU)法,色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6×250 nm,5 μm),流動相為B 0.1 mol/L磷酸二氫鈉-0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(用磷酸調(diào)至pH=4.5)：甲醇(85：15),A純乙腈；乙腈梯度洗脫,流速1 ml/mm,柱溫26-C,波長：230/450 nm,熒光檢測器檢測腦組織中興奮性及抑制性氨基酸含量。結(jié)果建立高效液相色譜法測定血漿中谷胱甘肽及半胱氨酸模型,GSH、Cys及青霉胺分別在2.9 min.4.0 min及9.0 min被分離出,峰型良好,分離度高。GSH在0.714～14.286 μg/ml范圍內(nèi),線性良好,標準曲線方程為Y=15.153X+8.043,相關系數(shù)為0.9993；穩(wěn)定性試驗RSD7.61%；日內(nèi)精密度8.422,日內(nèi)回收率100.38%-103.47%；日間精密度8.518%,日間回收率98.16%-104.11%。Cys在0.714～14.286μg/ml范圍內(nèi),線性良好,標準曲線方程為Y=17.813X+653.89,相關系數(shù)為0.9994；穩(wěn)定性試驗RSD8.01%；日內(nèi)精密度5.965%,日內(nèi)回收率97.41%-101.48%；日間精密度7.611%,日間回收率99.79%-108.68%。建立高效液相色譜法測定腦組織中Asp、Glu、Gly及GABA模型,Asp、Glu、Gly及GABA分別在3.5 min、5.0 min、5.6 min及18.4min被分離出,峰型良好,分離度高。Asp在25-500μg/ml范圍內(nèi),線性良好,標準曲線方程為Y=373.95X+3654.60,相關系數(shù)為0.9998；穩(wěn)定性試驗RSD8.965%；日內(nèi)精密度7.526%,日內(nèi)回收率99.68%-105.69%；日間精密度7.806%,日間回收率94.78%-97.33%。Glu在25-500μg/ml范圍內(nèi),線性良好,標準曲線方程為Y=343.83X+1575.80,相關系數(shù)為0.9994；穩(wěn)定性試驗RSD6.512%；日內(nèi)精密度7.308%,日內(nèi)回收率97.80%-101.50%；日間精密度7.599%,日間回收率95.50%-107.50%。Gly在25～500 μg/ml范圍內(nèi),線性良好,標準曲線方程為Y=989.64X+4972.90,相關系數(shù)為0.9995；穩(wěn)定性試驗RSD5.793%；日內(nèi)精密度5.653%,日內(nèi)回收率98.57%-107.67%；日間精密度6.632%,日間回收率98.23%-104.64%。GABA在25-500 μ/ml范圍內(nèi),線性良好,標準曲線方程為Y=697.23X+4612.40,相關系數(shù)為0.9997；穩(wěn)定性試驗RSD7.925%；日內(nèi)精密度8.018%,日內(nèi)回收率98.86%-109.46%：日間精密度8.890%,日間回收率92.66%-104.34%。急性鉈中毒染毒對照組、PB組、HP組及PB+HP之間,血漿GSH及Cys濃度均存在差異,主體內(nèi)效應檢驗P值均0.05,說明不同時間點GSH及Cys濃度依據(jù)分組不同存在差異；主體間效應檢驗P值均0.05,說明各治療組與對照組之間GSH以及Cys濃度存在統(tǒng)計學差異,其中普魯士藍聯(lián)合血液灌流組下降最為明顯。PB組、HP組及PB+HP組與染毒對照組比較,皮層、下丘腦及海馬區(qū)Asp及Glu含量存在差異,P值均0.05,其余腦區(qū)無明顯變化。PB組、HP組及PB+HP組與染毒對照組比較,各腦區(qū)抑制性氨基酸含量變化不明顯。結(jié)論本實驗建立的HPLC測量血漿GSH及Cys含量方法及HPLC測量腦組織中Asp、Glu、Gly及GABA方法精確靈敏,穩(wěn)定性高,可用于鉈中毒犬血漿中GSH、Cys及腦組織中四種氨基酸的快速檢測。犬急性鉈中毒后血漿GSH及Cys均出現(xiàn)明顯下降,經(jīng)PB、HP及二者聯(lián)合治療后下降程度降低,PB+HP組最為明顯。急性鉈中毒犬各腦區(qū)EAA及IAA含量不等,犬經(jīng)PB、HP及二者聯(lián)合治療后,皮層、下丘腦及海馬EAA含量較中毒對照組均有所下降,PB+HP組下降最為明顯,IAA無明顯變化。綜合分析提示GSH、Cys與EAA在急性鉈中毒致病機制中發(fā)揮一定的作用,PB、HP及PB+HP治療均有效,PB+HP效果最為明顯,可能是救治急性鉈中毒最為理想的手段。
【關鍵詞】：鉈中毒 HPLC 巰基化合物 興奮性氨基酸 抑制性氨基酸
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R595
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-20
• 1. 鉈中毒現(xiàn)狀及損傷機制14-15
• 1.1 競爭性抑制鉀離子14
• 1.2 與巰基結(jié)合14
• 1.3 與核黃素結(jié)合14-15
• 1.4 鉈的細胞毒性15
• 1.5 鉈導致脂質(zhì)過氧化15
• 1.6 其他損傷機制15
• 2. 鉈中毒治療進展15-17
• 2.1 一般治療15
• 2.2 應用解毒劑15-16
• 2.3 血液凈化治療16-17
• 2.4 普魯士藍聯(lián)合血液凈化治療17
• 2.5 對癥支持治療17
• 3. 谷胱甘肽及半胱氨酸與脂質(zhì)過氧化17-18
• 4. 興奮性、抑制性氨基酸及其損傷機理18
• 5. 高效液相色譜法測定樣品的特點及優(yōu)勢18-19
• 6. 實驗指導思想、研究思路和研究方法19-20
• 第一部分：基于高效液相色譜法構(gòu)建血漿中谷胱甘肽、半胱氨酸含量的監(jiān)測方法20-25
• 1. 實驗材料20-21
• 1.1 實驗儀器20
• 1.2 實驗試劑20
• 1.3 液體配制20-21
• 2. 實驗方法21-22
• 2.1 色譜條件21
• 2.2 血漿樣品處理方法21
• 2.3 標準曲線繪制21-22
• 2.4 穩(wěn)定性試驗22
• 2.5 精密度試驗22
• 3. 實驗結(jié)果22-24
• 3.1 標準曲線22-23
• 3.2 穩(wěn)定性試驗23
• 3.3 精密度試驗23-24
• 4. 討論24-25
• 第二部分：基于高效液相色譜法構(gòu)建腦組織中興奮性及抑制性氨基酸的監(jiān)測方法25-29
• 1. 實驗材料25-26
• 1.1 實驗儀器25
• 1.2 實驗試劑25
• 1.3 液體配制25-26
• 2. 實驗方法26-27
• 2.1 色譜條件26
• 2.2 標準曲線繪制26
• 2.3 穩(wěn)定性試驗26-27
• 2.4 精密度試驗27
• 3. 實驗結(jié)果27-28
• 3.1 標準曲線27
• 3.2 穩(wěn)定性試驗27-28
• 3.3 精密度試驗28
• 4. 討論28-29
• 第三部分：不同治療手段對犬急性鉈中毒后血漿中巰基化合物及腦組織中氨基酸含量的影響29-40
• 1. 實驗材料29-31
• 1.1 實驗動物29
• 1.2 實驗儀器29
• 1.3 實驗試劑29-30
• 1.4 液體配制30-31
• 2. 實驗方法31-32
• 2.1 動物分組31
• 2.2 染毒對照組處理方法31
• 2.3 普魯士藍治療組處理方法31-32
• 2.4 血液灌流組處理方法32
• 2.5 普魯士藍聯(lián)合血液灌流組處理方法32
• 2.6 血漿中巰基化合物含量的測定32
• 2.7 腦組織中氨基酸含量的測定32
• 3. 統(tǒng)計方法32
• 4. 結(jié)果32-36
• 4.1 各治療組犬血漿中谷胱甘肽的變化32-33
• 4.2 各治療組犬血漿中半胱氨酸的變化33-34
• 4.3 各治療組犬腦組織興奮性及抑制性氨基酸的含量34-35
• 4.4 各治療組犬的生存曲線35-36
• 4.5 犬在治療期間狀態(tài)的觀察36
• 5. 討論36-40
• 5.1 鉈中毒對血漿巰基化合物的影響36-38
• 5.2 鉈中毒對腦組織EAA及IAA的影響38-39
• 5.3 不同手段對鉈中毒犬治療效果分析39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-47
• 綜述 鉈中毒機制研究進展47-53
• 參考文獻50-53
• 論著 高效液相色譜法測定鉈中毒犬不同腦區(qū)興奮性及抑制性氨基酸含量變化53-61
• 個人簡歷61-62
• 致謝62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉春雅;劉敏;;血液灌流搶救重癥急性中毒的臨床觀察[J];當代醫(yī)學(學術版);2008年04期

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本文編號：1112683