發(fā)布時(shí)間：2017-10-28 19:16

  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚順鉑耳毒性模型及損傷后毛細(xì)胞再生的研究

  更多相關(guān)文章： 斑馬魚 順鉑 耳毒性模型 地塞米松 毛細(xì)胞再生

【摘要】：背景斑馬魚(zebrafish)作為新興脊柱模式生物,具有個(gè)體小、養(yǎng)殖簡易、體外受精、體外發(fā)育、生殖周期短、繁殖能力強(qiáng)、胚胎透明、品系繁多等特點(diǎn),且基因與人類基因約87%相似。斑馬魚雖無外耳和中耳,但具脊椎動物之典型內(nèi)耳結(jié)構(gòu)。除內(nèi)耳外,斑馬魚還具有另一感覺神經(jīng)器官——側(cè)線,其由大量單個(gè)神經(jīng)丘組成,每個(gè)神經(jīng)丘包含一簇感覺毛細(xì)胞。尤為重要的是,斑馬魚毛細(xì)胞在損傷后具有強(qiáng)大再生能力。有鑒于此,國際上有研究者利用斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)研究毛細(xì)胞發(fā)育、損傷及再生；部分研究者亦采用成年斑馬魚研究內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷及再生。順鉑為臨床常用的抗腫瘤藥物,在治療腫瘤的同時(shí)也伴有不同程度副作用,損傷人類內(nèi)耳毛細(xì)胞并導(dǎo)致永久性感音神經(jīng)性聽力損失為其嚴(yán)重副作用之一,但其損傷機(jī)制仍未完全明確。既往研究認(rèn)為哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷是不可逆的,而鳥類、魚類及兩棲類等低等脊柱生物,其毛細(xì)胞損傷后卻存在不同程度再生。近年有研究表明,哺乳動物前庭及內(nèi)耳新生毛細(xì)胞也具微弱的再生潛能,這為人類聽覺毛細(xì)胞再生點(diǎn)燃希望。因此,加強(qiáng)內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷、再生機(jī)制以及相關(guān)基因治療研究顯得尤為重要。既往研究中,已有順鉑損傷哺乳動物、鳥類內(nèi)耳毛細(xì)胞的研究報(bào)告,但尚無順鉑損傷成年魚類內(nèi)耳毛細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)告,本研究通過建立成年斑馬魚順鉑耳毒性模型將彌補(bǔ)國內(nèi)外相關(guān)研究領(lǐng)域的空白,有助進(jìn)一步揭示順鉑損傷機(jī)制。亦有研究表明順鉑損傷離體培育的小雞毛細(xì)胞后并不存在損傷后毛細(xì)胞再生,鑒于斑馬魚模型的優(yōu)勢及其毛細(xì)胞強(qiáng)大自發(fā)再生能力,本實(shí)驗(yàn)以成年及幼體斑馬魚為對象研究順鉑耳毒性損傷,探討順鉑損傷對毛細(xì)胞再生的影響,揭示順鉑損傷后成年及幼體斑馬魚毛細(xì)胞再生的異同,也為今后斑馬魚毛細(xì)胞再生相關(guān)基因研究打下一定基礎(chǔ)。目的于國內(nèi)、外首次建立成年斑馬魚順鉑耳毒性損傷模型,彌補(bǔ)相關(guān)研究領(lǐng)域的空白；探討順鉑對成年斑馬魚內(nèi)耳及幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的毒性損傷和順鉑損傷對毛細(xì)胞再生的影響,為揭示調(diào)控毛細(xì)胞再生相關(guān)基因打下基礎(chǔ)。研究內(nèi)容及方法1.順鉑損傷成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞及損傷后毛細(xì)胞增殖檢測1.1成年斑馬魚腹腔注射給藥取發(fā)育4-5月齡成年斑馬魚,雌雄隨機(jī),重量介于0.38～0.55g之間。隨機(jī)分為順鉑組、慶大霉素組及生理鹽水對照組,每組6條。順鉑組給予連續(xù)兩次注射24mg/kg順鉑溶液,間隔12h；慶大霉素組首次注射與順鉑組等量生理鹽水,12h后注射250mg/kg硫酸慶大霉素溶液；對照組連續(xù)兩次注射與順鉑組等量生理鹽水。1.2成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛染色末次腹腔注射后第1d、10d,麻醉并處死部分順鉑組及對照組斑馬魚。斷頭后置于4%多聚甲醛中,4℃下固定過夜,PBS清洗,體視顯微鏡下解剖并分離內(nèi)耳各結(jié)構(gòu)(球囊斑、聽壺斑及橢圓囊斑)。解剖后的內(nèi)耳組織于1：100FITC-鬼筆環(huán)肽中避光染色1h,PBS清洗,鋪片,熒光顯微鏡下觀察、拍照。1.3成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞增殖染色末次腹腔注射后24h、48h、72h,各組均經(jīng)腹腔注射(5mg/ml)Brdu,恢復(fù)10h,麻醉、斷頭處死斑馬魚,解剖固定如上訴。分別取解剖后內(nèi)耳組織在4℃下于濃度為1：100鼠單克隆抗Brdu抗體培育過夜,PBS漂洗,1：200兔抗鼠Alexa Fluor488共軛二抗室溫下處理1h,PBS漂洗,鋪片,滴Dapi染液,蓋片,熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)Brdu陽性細(xì)胞。2.順鉑損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞及地塞米松促側(cè)線毛細(xì)胞增生的探討取受精后5天(5dpf)斑馬魚幼魚,隨機(jī)分組,每組10-15條不等；神經(jīng)丘毛細(xì)胞染色選擇2μM熒光活性染液Yo-Pro-1;選擇P1、P7、P8三個(gè)固定側(cè)線神經(jīng)丘行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。2.1順鉑損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞5dpf斑馬魚幼魚于2μM Yo-Pro-1染色30分鐘,隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組加入1nM順鉑溶液,對照組加入等量系統(tǒng)水,暗室內(nèi)培育3h、6h。撤藥后Oh、3h、6h于熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)神經(jīng)丘內(nèi)毛細(xì)胞。2.2地塞米松促進(jìn)幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞增生取5dpf斑馬魚幼魚隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組加入濃度為100μM、25μM地塞米松溶液,對照組加入等量系統(tǒng)水,培育48h,撤藥即刻行Yo-Pro-1染色,熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)神經(jīng)丘內(nèi)毛細(xì)胞。3.3地塞米松對順鉑、新霉素?fù)p傷后側(cè)線毛細(xì)胞再生的影響取5dpf斑馬魚幼魚,隨機(jī)分為對照組、順鉑組、新霉素組。順鉑組加入1nM順鉑溶液處理3h,新霉素組加入200州硫酸新霉素溶液處理1h,兩組在撤藥后3h均加入25州地塞米松溶液或等量系統(tǒng)水,對照組加入等量系統(tǒng)水。于地塞米松作用后24h、48h分別行Yo-Pro-1染色,熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)神經(jīng)丘內(nèi)毛細(xì)胞。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析資料分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多重比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),方差齊性檢驗(yàn)采取Levene檢驗(yàn)。設(shè)P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.順鉑注射對成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞束密度的影響通過FITC-鬼筆環(huán)肽染色,發(fā)現(xiàn)斑馬魚聽覺感覺上皮球囊、橢圓囊、聽壺具有各自不同的形態(tài)；在末次順鉑注射后第1天,選取球囊斑喙端至尾端軸線上面積為1600μm2的四個(gè)固定區(qū)域(5%,25%,50%,75%)行毛細(xì)胞束計(jì)數(shù),得出四個(gè)區(qū)域毛細(xì)胞束均數(shù)分別為：36.25±2.82、19.75±2.12、16.50±1.93、19.62±2.33(N=7-9),經(jīng)統(tǒng)計(jì)同一部位順鉑組毛細(xì)胞束均少于對照組(P0.05)。在末次順鉑注射后第10天,計(jì)數(shù)得出球囊斑四個(gè)區(qū)域的毛細(xì)胞束均數(shù)分別為：38.83±2.32、25.14±2.41、19.86±1.77,26.71±2.50(N=6-7),經(jīng)統(tǒng)計(jì)25%區(qū)域毛細(xì)胞束少于對照組(P0.05),其余各區(qū)域毛細(xì)胞束與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.順鉑損傷后成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞的增殖檢測通過Brdu染色發(fā)現(xiàn)正常成年斑馬魚內(nèi)耳感覺上皮內(nèi)存在零散的增殖細(xì)胞。選取球囊斑行增殖細(xì)胞計(jì)數(shù),得出在連續(xù)腹腔注射24mg/kg順鉑溶液后24h、48h,每塊球囊斑內(nèi)增殖細(xì)胞數(shù)分別為： 7.29±1.50、10.71±2.21(N=7),明顯少于對照組(P0.05)及慶大霉素組(P0.001),而連續(xù)順鉑注射后72h,每塊球囊斑內(nèi)增殖細(xì)胞數(shù)為：25.71±3.45(N=7),明顯多于同期對照組(P0.001)；在硫酸慶大霉素注射后24h、48h、72h均可檢測到大量增殖細(xì)胞,但隨著時(shí)間的推移增殖細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,經(jīng)統(tǒng)計(jì)三個(gè)時(shí)間段球囊斑內(nèi)增殖細(xì)胞數(shù)均多于同期生理鹽水對照組(P0.005)。3.順鉑損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞1nM順鉑處理6h組在撤藥后0h、3h計(jì)數(shù)P1、P7、P8三個(gè)神經(jīng)丘得出毛細(xì)胞均數(shù)為：1.970±0.526(N=11),1.767±0.629(N=10)；而1nM順鉑處理3h組在撤藥后0h、3h、6h計(jì)數(shù)得到毛細(xì)胞均數(shù)為：5.909±0.761(N=11),2.633±0.483(N=10),2.528±0.643(N=12)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)各順鉑處理組的側(cè)線毛細(xì)胞數(shù)量均少于正常對照組(P0.05)。4.地塞米松促進(jìn)正常幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的增生10μM、25μM地塞米松溶液處理5dpf斑馬魚48h,在撤藥后計(jì)數(shù)毛細(xì)胞的數(shù)量分別為：11.028±1.314(N=12),11.364-1.545(N=11)；同一部位7dpf對照組毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為：9.922±0.862(N=13)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)10μM、25μM地塞米松組與7dpf對照組相比神經(jīng)丘毛細(xì)胞數(shù)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.地塞米松促進(jìn)新霉素而非順鉑損傷后幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的增生通過計(jì)數(shù)側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞,經(jīng)單向方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果：新霉素+地塞米松24h組vs新霉素24h組,P=0.178,二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；新霉素+地塞米松48h組vs新霉素48h組,P=0.001,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在25μM地塞米松處理后24h、48h,順鉑+地塞米松組與損傷對照組相比,兩組毛細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1.經(jīng)腹腔連續(xù)兩次注射24mg/kg順鉑溶液(間隔12小時(shí))可損傷成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞；正常情況下,成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞存在自發(fā)更新現(xiàn)象；在耳毒性藥物慶大霉素?fù)p傷后可迅速啟動毛細(xì)胞再生,相對于慶大霉素?fù)p傷,順鉑損傷可延緩成年斑馬魚內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生進(jìn)程。2.1nM順鉑浸泡給藥可快速損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞,且順鉑損傷存在時(shí)間依賴性；新霉素?fù)p傷后側(cè)線毛細(xì)胞可快速再生,而順鉑損傷后側(cè)線毛細(xì)胞的再生速度相對緩慢。3.地塞米松可促進(jìn)正常及新霉素?fù)p傷后幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的增生,但并不能有效促進(jìn)順鉑損傷后側(cè)線毛細(xì)胞的再生。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 順鉑 耳毒性模型 地塞米松 毛細(xì)胞再生
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R764
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-21
• 第一章 成年斑馬魚順鉑耳毒性模型的建立及順鉑損傷后毛細(xì)胞再生研究21-33
• 引言21
• 1 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-29
• 4 結(jié)論29
• 5 討論29-33
• 第二章 順鉑損傷幼體斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞及地塞米松促進(jìn)側(cè)線毛細(xì)胞再生的探討33-47
• 引言33
• 1 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 2 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-41
• 4 結(jié)論41
• 5 討論41-47
• 全文總結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 綜述54-62
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 中英文縮略詞表62-63
• 碩士期間成果63-64
• 致謝64-65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1109587