本文關鍵詞：鹽酸小檗堿對草魚補體C3作用機理及藥代動力學研究

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【摘要】：近年來,免疫學在水產(chǎn)上的研究已成為研究水產(chǎn)動物病害的熱點之一,免疫機制的研究為合理有效地防治各類動物疾病提供依據(jù)。傳統(tǒng)的預防與治療水產(chǎn)動物疾病以使用抗生素為主,但不良反應多,副作用顯著。然而人們發(fā)現(xiàn)越來越多的中藥不僅具有良好的抗菌和提供免疫力的作用而且副作用少。黃連具有清熱解毒及殺菌的功效,其主要化學成分是生物堿,例如,小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、藥根堿,其中小檗堿含量約6%-10%。已有文獻報道黃連可以提高魚類的免疫力,因此,我們對黃連生物堿進行提取與分離并研究小檗堿對草魚補體C3作用的機理研究,闡明黃連提高水產(chǎn)類動物免疫力的物質基礎,為黃連在水產(chǎn)上的應用與開發(fā)提供理論依據(jù)本論文的主要內容與結果1、黃連中生物堿的提取分離與鑒定運用高速逆流色譜法(HSCCC),以氯仿-甲醇-0.2 mol/L鹽酸作為溶劑體系從黃連的生物堿粗提物中進一步分離制備了4種生物堿類化合物,通過1H NMR和13C NMR核磁波譜技術并結合相關文獻報道確定4個化合物分別為小檗堿、巴馬汀、表小檗堿及黃連堿。與傳統(tǒng)的分離方法相比,高速逆流色譜法(HSCCC)具有分離周期短,溶劑用量少,操作簡便快捷,在中藥成分分離上具有獨特的優(yōu)勢。2、鹽酸小檗堿對感染嗜水氣單胞菌草魚存活率的影響實驗取體重均勻且健康的草魚150條,隨機分為5組:對照組(NC)、模型組(M)、鹽酸小檗堿0.06%組(BBR-L)、鹽酸小檗堿0.12%組(BBR-M)、鹽酸小檗堿0.24%組(BBR-H)。實驗組投喂相應的濃度的鹽酸小檗堿飼料,對照組與模型組投喂基礎飼料,每天投喂飼料10 g/尾,連續(xù)投喂14天后,模型組和實驗組腹腔注射0.2 mL嗜水氣單胞菌(108 cfu/m L),對照組注射等量的無菌生理鹽水。記錄草魚死亡情況,實驗重復三次,取三次實驗的平均值。結果顯示給藥組草魚的存活率分別為50%、70%、73.3%,模型組(M)存活率僅為10%,對照組沒有死亡情況。經(jīng)統(tǒng)計分析,各個藥物濃度試驗組草魚存活率均顯著提高(p0.01)。表明鹽酸小檗堿能提高草魚的免疫力,且與劑量相關。3、鹽酸小檗堿對草魚非特異性免疫指標的影響本實驗取80條體型大小相似的草魚隨機分為4組,每組20條,分別為對照組(nc)、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組,給藥組投喂相應的濃度的鹽酸小檗堿飼料,對照組投喂基礎飼料。各組每天投喂飼料10g/尾,觀察草魚進食和活動情況,在第7天和第14天尾靜脈取血,測定草魚免疫指標補體c3含量、溶菌酶活性、呼吸爆發(fā)活性。實驗數(shù)據(jù)使用spss16.0統(tǒng)計軟件進行分析,結果以平均值±標準差表示,采用單因素方差分析及l(fā)sd對樣品進行多重比較。實驗結果表明:在第七天,0.12%和0.24%鹽酸小檗堿給藥組血清中補體c3含量與對照組相比顯著性提高(p0.05),溶菌酶活性和呼吸爆發(fā)活性均有所上升,但未見顯著性差異(p0.05);第14天,各濃度給藥組的草魚補體c3含量均表現(xiàn)顯著性提高(p0.05);溶菌酶活性升高,但均未達顯著差異(p0.05);0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組呼吸爆發(fā)活性升高且具有顯著性差異(p0.05),0.06%鹽酸小檗堿給藥組活性雖有升高,但未見顯著差異(p0.05)。表明鹽酸小檗堿能提高草魚的非特異性免疫功能。4、鹽酸小檗堿對草魚補體c3mrna表達的影響隨機將80條健康且體型大小相似的草魚分為4組,分別為對照組、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組。試驗組投喂相應的濃度的鹽酸小檗堿飼料,對照組投喂基礎飼料,每天投喂飼料10g/尾。觀察草魚進食情況和活動情況,喂養(yǎng)14天后,麻醉后殺死,取其肝臟,提取草魚肝臟補體c3mrna,利用primer5引物設計軟件設計引物,采用10μl逆轉錄反應體系合成cdna,用核酸定量儀測定rna濃度。實驗數(shù)據(jù)使用spss16.0統(tǒng)計軟件進行分析,結果以平均值±標準差表示,采用單因素方差分析及l(fā)sd對樣品進行多重比較。pcr結果顯示,0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組補體c3mrna表達均上調,與對照組比較,各給藥組補體c3mrna表達上調比例分別為20.57%、27.35%、26.49%,具有顯著性差異(p0.05),上調的趨勢與血清中補體c3的結果類似。研究表明鹽酸小檗堿能上調草魚補體c3mrna的表達。5、補體消耗試驗草魚空白血清中加入鹽酸小檗堿配制成2mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l,80mg/l的鹽酸小檗堿血清溶液,進行補體消耗試驗。實驗結果表明:鹽酸小檗堿在血清中濃度達到5mg/l,可以激活補體c3,但未達顯著水平。當鹽酸小檗堿濃度達到10mg/l,激活作用達到顯著水平(p0.05)。表明高濃度的鹽酸小檗堿通過與補體c3的結合改變補體c3的構型從而激活補體c3,激活程度呈劑量依賴關系。6、草魚體內鹽酸小檗堿藥代動力學研究取健康草魚72條(500±10 g),按48mg/kg魚體重灌服鹽酸小檗堿(5mg/m L),分別在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、24h、36h尾靜脈采血,各時間點設置6個重復,同時取空白血漿做方法學試驗。實驗方法學表明,本方法穩(wěn)定性好,具有可重復性,藥代動力學實驗結果顯示藥-時曲線出現(xiàn)2個峰,分別為0.243 mg/L和0.117mg/L。該劑量下的峰濃度Cmax低于鹽酸小檗堿激活補體C3所需的濃度(5 mg/L)。實驗結果表明灌服該劑量的鹽酸小檗堿,體內血藥濃度不足以達到激活補體C3所需濃度。
【關鍵詞】：草魚 黃連 鹽酸小檗堿 補體C3 藥代動力學
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R285
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 第1章 文獻綜述14-24
• 1.1 黃連概述14
• 1.2 我國魚病害主要現(xiàn)狀14-15
• 1.2.1 生物引起的疾病14
• 1.2.2 非生物引起的疾病14-15
• 1.3 黃連在治療魚病作用的研究現(xiàn)狀15-18
• 1.3.1 抑菌、殺菌作用15
• 1.3.2 免疫調劑作用15-16
• 1.3.3 驅殺寄生蟲、抗病毒作用16-17
• 1.3.4 誘食作用17-18
• 1.4 補體系統(tǒng)在魚類免疫能中的作用18-24
• 1.4.1 補體系統(tǒng)18-20
• 1.4.2 硬骨魚補體系統(tǒng)的特點20
• 1.4.3 補體對病原體的作用20-24
• 第2章 引言24-26
• 2.1 立題依據(jù)24-25
• 2.2 研究的主要內容25-26
• 第3章 黃連中生物堿的提取分離與鑒定26-34
• 3.1 實驗材料和儀器26-27
• 3.1.1 實驗材料與試劑26-27
• 3.2 實驗方法27
• 3.2.1 黃連總生物堿的制備27
• 3.2.2 高速逆流色譜法（HSCCC）分離27
• 3.3 結果與分析27-32
• 3.3.1 溶液系統(tǒng)的選擇27-30
• 3.3.2 HSCCC分離制備的結果30-31
• 3.3.3 結構鑒定31-32
• 3.4 結論32-34
• 第4章 鹽酸小檗堿對感染嗜水氣單胞菌草魚存活率的影響34-40
• 4.1 實驗材料和儀器34-35
• 4.1.1 主要試劑34
• 4.1.2 主要儀器34
• 4.1.3 實驗細菌34-35
• 4.1.4 實驗動物35
• 4.2 實驗方法35-37
• 4.2.1 細菌溶液制備35
• 4.2.2 細菌濃度的確定（麥氏比濁法）35-36
• 4.2.3 制備實驗飼料36
• 4.2.4 實驗設計36-37
• 4.2.5 數(shù)據(jù)處理37
• 4.3 實驗結果37
• 4.4 小結與討論37-40
• 第5章 鹽酸小檗堿對草魚非特異性免疫功能的影響40-48
• 5.1 實驗材料和儀器40-41
• 5.1.1 主要試劑40
• 5.1.2 主要儀器40-41
• 5.1.3 實驗動物41
• 5.2 實驗方法41-43
• 5.2.1 制備實驗飼料41
• 5.2.2 實驗設計41-43
• 5.2.3 數(shù)據(jù)處理43
• 5.3 實驗結果43-46
• 5.3.1 鹽酸小檗堿對草魚血清中補體C3含量變化的影響43-44
• 5.3.2 鹽酸小檗堿對草魚血清溶菌酶活性影響44-45
• 5.3.3 鹽酸小檗堿對NBT活性的影響45-46
• 5.4 小結與討論46-48
• 5.4.1 鹽酸小檗堿對草魚血清中補體C3的影響46-47
• 5.4.2 鹽酸小檗堿對草魚溶菌酶活性的影響47
• 5.4.3 鹽酸小檗堿對草魚NBT活性的影響47-48
• 第6章 鹽酸小檗堿對草魚補體C3 mRNA表達的影響48-52
• 6.1 實驗材料和儀器48-49
• 6.1.1 主要試劑48-49
• 6.1.2 主要儀器49
• 6.1.3 實驗動物49
• 6.2 實驗方法49-50
• 6.2.1 制備飼料49
• 6.2.2 實驗分組49
• 6.2.3 草魚肝臟補體C3mRNA提取49-50
• 6.2.4 設計引物50
• 6.2.5 反轉錄及熒光定量PCR50
• 6.2.6 數(shù)據(jù)處理50
• 6.3 實驗結果50-51
• 6.4 小結與討論51-52
• 第7章 補體消耗試驗52-56
• 7.1 實驗材料與儀器52-53
• 7.1.1 主要試劑52
• 7.1.2 主要儀器52
• 7.1.3 實驗動物52-53
• 7.2 實驗方法53
• 7.2.1 補體消耗試驗53
• 7.2.2 數(shù)據(jù)處理53
• 7.3 實驗結果53-54
• 7.4 小結與討論54-56
• 第8章 鹽酸小檗堿在草魚體內藥代動力學研究56-64
• 8.1 實驗材料和儀器56-57
• 8.1.1 主要試劑56
• 8.1.2 主要儀器56
• 8.1.3 實驗動物56
• 8.1.4 色譜條件56-57
• 8.2 實驗方法57-58
• 8.2.1 實驗溶液的配制57
• 8.2.2 血液樣品前處理57
• 8.2.3 方法學驗證57-58
• 8.2.3.1 專屬性考察57
• 8.2.3.2 標準曲線的制備57-58
• 8.2.3.3 回收率和精密度58
• 8.2.4 實驗設計58
• 8.2.5 數(shù)據(jù)處理58
• 8.3 實驗結果58-62
• 8.3.1 專屬性考察58-59
• 8.3.2 標準曲線與最低檢測限（LLOQ）59-60
• 8.3.3 回收率和精密度60-61
• 8.3.4 口灌鹽酸小檗堿藥時曲線61-62
• 8.4 小結與討論62-64
• 第9章 結論與展望64-66
• 參考文獻66-72
• 附錄72-76
• 致謝76-78
• 碩士研究生期間發(fā)表的學術論文78

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1 張程;宋雪慧;于博;包玉敏;張力;;分光光度法測定黃瓜籽粉中鹽酸小檗堿的含量[J];光譜實驗室;2010年03期

2 張永;黎紅平;李慈梅;;鹽酸小檗堿對血漿游離血紅蛋白的影響[J];現(xiàn)代醫(yī)院;2012年08期

3 岳淑梅,何穎,張啟明;三波長分光光度法測定連蒲雙清片中鹽酸小檗堿的含量[J];中成藥;1999年02期

4 徐燕,袁軍;淀粉對鹽酸小檗堿溶出的影響[J];中國藥業(yè);1999年01期

5 李仲昆,王崇靜,尹為民,王珩,李冰;鹽酸小檗堿栓的研制[J];中草藥;2000年11期

6 王仁娣,蘇伯萍,嚴常開,劉煒;雙波長薄層掃描法測定創(chuàng)靈油中鹽酸小檗堿的含量[J];中國藥師;2000年05期

7 涂立新;反相高效液相色譜法測定，

本文編號：1080653