本文關(guān)鍵詞：鹽酸小檗堿對(duì)草魚補(bǔ)體C3作用機(jī)理及藥代動(dòng)力學(xué)研究

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【摘要】：近年來(lái),免疫學(xué)在水產(chǎn)上的研究已成為研究水產(chǎn)動(dòng)物病害的熱點(diǎn)之一,免疫機(jī)制的研究為合理有效地防治各類動(dòng)物疾病提供依據(jù)。傳統(tǒng)的預(yù)防與治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病以使用抗生素為主,但不良反應(yīng)多,副作用顯著。然而人們發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的中藥不僅具有良好的抗菌和提供免疫力的作用而且副作用少。黃連具有清熱解毒及殺菌的功效,其主要化學(xué)成分是生物堿,例如,小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、藥根堿,其中小檗堿含量約6%-10%。已有文獻(xiàn)報(bào)道黃連可以提高魚類的免疫力,因此,我們對(duì)黃連生物堿進(jìn)行提取與分離并研究小檗堿對(duì)草魚補(bǔ)體C3作用的機(jī)理研究,闡明黃連提高水產(chǎn)類動(dòng)物免疫力的物質(zhì)基礎(chǔ),為黃連在水產(chǎn)上的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)本論文的主要內(nèi)容與結(jié)果1、黃連中生物堿的提取分離與鑒定運(yùn)用高速逆流色譜法(HSCCC),以氯仿-甲醇-0.2 mol/L鹽酸作為溶劑體系從黃連的生物堿粗提物中進(jìn)一步分離制備了4種生物堿類化合物,通過(guò)1H NMR和13C NMR核磁波譜技術(shù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定4個(gè)化合物分別為小檗堿、巴馬汀、表小檗堿及黃連堿。與傳統(tǒng)的分離方法相比,高速逆流色譜法(HSCCC)具有分離周期短,溶劑用量少,操作簡(jiǎn)便快捷,在中藥成分分離上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。2、鹽酸小檗堿對(duì)感染嗜水氣單胞菌草魚存活率的影響實(shí)驗(yàn)取體重均勻且健康的草魚150條,隨機(jī)分為5組:對(duì)照組(NC)、模型組(M)、鹽酸小檗堿0.06%組(BBR-L)、鹽酸小檗堿0.12%組(BBR-M)、鹽酸小檗堿0.24%組(BBR-H)。實(shí)驗(yàn)組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料,對(duì)照組與模型組投喂基礎(chǔ)飼料,每天投喂飼料10 g/尾,連續(xù)投喂14天后,模型組和實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0.2 mL嗜水氣單胞菌(108 cfu/m L),對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水。記錄草魚死亡情況,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取三次實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果顯示給藥組草魚的存活率分別為50%、70%、73.3%,模型組(M)存活率僅為10%,對(duì)照組沒(méi)有死亡情況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,各個(gè)藥物濃度試驗(yàn)組草魚存活率均顯著提高(p0.01)。表明鹽酸小檗堿能提高草魚的免疫力,且與劑量相關(guān)。3、鹽酸小檗堿對(duì)草魚非特異性免疫指標(biāo)的影響本實(shí)驗(yàn)取80條體型大小相似的草魚隨機(jī)分為4組,每組20條,分別為對(duì)照組(nc)、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組,給藥組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料,對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料。各組每天投喂飼料10g/尾,觀察草魚進(jìn)食和活動(dòng)情況,在第7天和第14天尾靜脈取血,測(cè)定草魚免疫指標(biāo)補(bǔ)體c3含量、溶菌酶活性、呼吸爆發(fā)活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析及l(fā)sd對(duì)樣品進(jìn)行多重比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在第七天,0.12%和0.24%鹽酸小檗堿給藥組血清中補(bǔ)體c3含量與對(duì)照組相比顯著性提高(p0.05),溶菌酶活性和呼吸爆發(fā)活性均有所上升,但未見(jiàn)顯著性差異(p0.05);第14天,各濃度給藥組的草魚補(bǔ)體c3含量均表現(xiàn)顯著性提高(p0.05);溶菌酶活性升高,但均未達(dá)顯著差異(p0.05);0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組呼吸爆發(fā)活性升高且具有顯著性差異(p0.05),0.06%鹽酸小檗堿給藥組活性雖有升高,但未見(jiàn)顯著差異(p0.05)。表明鹽酸小檗堿能提高草魚的非特異性免疫功能。4、鹽酸小檗堿對(duì)草魚補(bǔ)體c3mrna表達(dá)的影響隨機(jī)將80條健康且體型大小相似的草魚分為4組,分別為對(duì)照組、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組。試驗(yàn)組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料,對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料,每天投喂飼料10g/尾。觀察草魚進(jìn)食情況和活動(dòng)情況,喂養(yǎng)14天后,麻醉后殺死,取其肝臟,提取草魚肝臟補(bǔ)體c3mrna,利用primer5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物,采用10μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cdna,用核酸定量?jī)x測(cè)定rna濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析及l(fā)sd對(duì)樣品進(jìn)行多重比較。pcr結(jié)果顯示,0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組補(bǔ)體c3mrna表達(dá)均上調(diào),與對(duì)照組比較,各給藥組補(bǔ)體c3mrna表達(dá)上調(diào)比例分別為20.57%、27.35%、26.49%,具有顯著性差異(p0.05),上調(diào)的趨勢(shì)與血清中補(bǔ)體c3的結(jié)果類似。研究表明鹽酸小檗堿能上調(diào)草魚補(bǔ)體c3mrna的表達(dá)。5、補(bǔ)體消耗試驗(yàn)草魚空白血清中加入鹽酸小檗堿配制成2mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l,80mg/l的鹽酸小檗堿血清溶液,進(jìn)行補(bǔ)體消耗試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:鹽酸小檗堿在血清中濃度達(dá)到5mg/l,可以激活補(bǔ)體c3,但未達(dá)顯著水平。當(dāng)鹽酸小檗堿濃度達(dá)到10mg/l,激活作用達(dá)到顯著水平(p0.05)。表明高濃度的鹽酸小檗堿通過(guò)與補(bǔ)體c3的結(jié)合改變補(bǔ)體c3的構(gòu)型從而激活補(bǔ)體c3,激活程度呈劑量依賴關(guān)系。6、草魚體內(nèi)鹽酸小檗堿藥代動(dòng)力學(xué)研究取健康草魚72條(500±10 g),按48mg/kg魚體重灌服鹽酸小檗堿(5mg/m L),分別在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、12h、24h、36h尾靜脈采血,各時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)重復(fù),同時(shí)取空白血漿做方法學(xué)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法學(xué)表明,本方法穩(wěn)定性好,具有可重復(fù)性,藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥-時(shí)曲線出現(xiàn)2個(gè)峰,分別為0.243 mg/L和0.117mg/L。該劑量下的峰濃度Cmax低于鹽酸小檗堿激活補(bǔ)體C3所需的濃度(5 mg/L)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明灌服該劑量的鹽酸小檗堿,體內(nèi)血藥濃度不足以達(dá)到激活補(bǔ)體C3所需濃度。
【關(guān)鍵詞】：草魚 黃連 鹽酸小檗堿 補(bǔ)體C3 藥代動(dòng)力學(xué)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R285
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 第1章 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 黃連概述14
• 1.2 我國(guó)魚病害主要現(xiàn)狀14-15
• 1.2.1 生物引起的疾病14
• 1.2.2 非生物引起的疾病14-15
• 1.3 黃連在治療魚病作用的研究現(xiàn)狀15-18
• 1.3.1 抑菌、殺菌作用15
• 1.3.2 免疫調(diào)劑作用15-16
• 1.3.3 驅(qū)殺寄生蟲(chóng)、抗病毒作用16-17
• 1.3.4 誘食作用17-18
• 1.4 補(bǔ)體系統(tǒng)在魚類免疫能中的作用18-24
• 1.4.1 補(bǔ)體系統(tǒng)18-20
• 1.4.2 硬骨魚補(bǔ)體系統(tǒng)的特點(diǎn)20
• 1.4.3 補(bǔ)體對(duì)病原體的作用20-24
• 第2章 引言24-26
• 2.1 立題依據(jù)24-25
• 2.2 研究的主要內(nèi)容25-26
• 第3章 黃連中生物堿的提取分離與鑒定26-34
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器26-27
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑26-27
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法27
• 3.2.1 黃連總生物堿的制備27
• 3.2.2 高速逆流色譜法（HSCCC）分離27
• 3.3 結(jié)果與分析27-32
• 3.3.1 溶液系統(tǒng)的選擇27-30
• 3.3.2 HSCCC分離制備的結(jié)果30-31
• 3.3.3 結(jié)構(gòu)鑒定31-32
• 3.4 結(jié)論32-34
• 第4章 鹽酸小檗堿對(duì)感染嗜水氣單胞菌草魚存活率的影響34-40
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器34-35
• 4.1.1 主要試劑34
• 4.1.2 主要儀器34
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)菌34-35
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物35
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法35-37
• 4.2.1 細(xì)菌溶液制備35
• 4.2.2 細(xì)菌濃度的確定（麥?zhǔn)媳葷岱ǎ?/span>35-36
• 4.2.3 制備實(shí)驗(yàn)飼料36
• 4.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)36-37
• 4.2.5 數(shù)據(jù)處理37
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37
• 4.4 小結(jié)與討論37-40
• 第5章 鹽酸小檗堿對(duì)草魚非特異性免疫功能的影響40-48
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器40-41
• 5.1.1 主要試劑40
• 5.1.2 主要儀器40-41
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物41
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法41-43
• 5.2.1 制備實(shí)驗(yàn)飼料41
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)41-43
• 5.2.3 數(shù)據(jù)處理43
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-46
• 5.3.1 鹽酸小檗堿對(duì)草魚血清中補(bǔ)體C3含量變化的影響43-44
• 5.3.2 鹽酸小檗堿對(duì)草魚血清溶菌酶活性影響44-45
• 5.3.3 鹽酸小檗堿對(duì)NBT活性的影響45-46
• 5.4 小結(jié)與討論46-48
• 5.4.1 鹽酸小檗堿對(duì)草魚血清中補(bǔ)體C3的影響46-47
• 5.4.2 鹽酸小檗堿對(duì)草魚溶菌酶活性的影響47
• 5.4.3 鹽酸小檗堿對(duì)草魚NBT活性的影響47-48
• 第6章 鹽酸小檗堿對(duì)草魚補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)的影響48-52
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器48-49
• 6.1.1 主要試劑48-49
• 6.1.2 主要儀器49
• 6.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物49
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法49-50
• 6.2.1 制備飼料49
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)分組49
• 6.2.3 草魚肝臟補(bǔ)體C3mRNA提取49-50
• 6.2.4 設(shè)計(jì)引物50
• 6.2.5 反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR50
• 6.2.6 數(shù)據(jù)處理50
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-51
• 6.4 小結(jié)與討論51-52
• 第7章 補(bǔ)體消耗試驗(yàn)52-56
• 7.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器52-53
• 7.1.1 主要試劑52
• 7.1.2 主要儀器52
• 7.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物52-53
• 7.2 實(shí)驗(yàn)方法53
• 7.2.1 補(bǔ)體消耗試驗(yàn)53
• 7.2.2 數(shù)據(jù)處理53
• 7.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-54
• 7.4 小結(jié)與討論54-56
• 第8章 鹽酸小檗堿在草魚體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究56-64
• 8.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器56-57
• 8.1.1 主要試劑56
• 8.1.2 主要儀器56
• 8.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物56
• 8.1.4 色譜條件56-57
• 8.2 實(shí)驗(yàn)方法57-58
• 8.2.1 實(shí)驗(yàn)溶液的配制57
• 8.2.2 血液樣品前處理57
• 8.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證57-58
• 8.2.3.1 專屬性考察57
• 8.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備57-58
• 8.2.3.3 回收率和精密度58
• 8.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)58
• 8.2.5 數(shù)據(jù)處理58
• 8.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-62
• 8.3.1 專屬性考察58-59
• 8.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測(cè)限（LLOQ）59-60
• 8.3.3 回收率和精密度60-61
• 8.3.4 口灌鹽酸小檗堿藥時(shí)曲線61-62
• 8.4 小結(jié)與討論62-64
• 第9章 結(jié)論與展望64-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 附錄72-76
• 致謝76-78
• 碩士研究生期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文78

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本文編號(hào)：1080653