本文關(guān)鍵詞：聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子、GLP-1和Gastrin在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞中的作用機(jī)制

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【摘要】：糖尿病作為一種慢性代謝性疾病嚴(yán)重影響著人們的健康,其主要病因?yàn)橐葝u素分泌相對和(或)絕對不足。胰島移植曾被認(rèn)為是根治糖尿病的有效療法,但因供體來源不足及免疫排斥等限制其在臨床工作中的應(yīng)用。目前非β細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞(insulin-producing cell,IPCs)移植治療糖尿病成為了世界范圍內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞之外的另一類干細(xì)胞。BMSCs多向分化、取材方便、體外易于培養(yǎng)及可自體移植等特性,使其成為誘導(dǎo)分化靶細(xì)胞的首選。在胰島β細(xì)胞分化發(fā)育的過程中,轉(zhuǎn)錄因子起著至關(guān)重要的作用,其中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子主要包括胰十二指腸同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox1,Pdx-1)、神經(jīng)元素3(Neurogenin 3,Ngn3)和V型肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源基因A(v-maf muscu-loaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A,Maf A)等。Pdx-1為胰腺發(fā)育過程中第一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其作用主要是維持胰腺前體細(xì)胞的發(fā)育,參與胰腺分化發(fā)育的全過程。外源性導(dǎo)入Pdx-1基因不僅可成功誘導(dǎo)BMSCs分化為IPCs,而且可促進(jìn)下游胰島素相關(guān)基因的表達(dá)。Ngn3是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵因子,其控制著胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞的分化方向,外源表達(dá)的Ngn3可促進(jìn)胰腺導(dǎo)管細(xì)胞向IPCs分化。Maf A是唯一特異存在于胰島β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子,其主要功能是在Pdx-1基因表達(dá)的前體下反式激活胰島素相關(guān)基因的表達(dá),參與胰腺β細(xì)胞的形成以及維持胰腺β細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合后可誘導(dǎo)BMSCs轉(zhuǎn)分化為永久編碼的IPCs。胰島β細(xì)胞的再生和生物功能的維持還需要一些胃腸激素的參與,例如胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和胃泌素(Gastrin)。GLP-1是腸粘膜L細(xì)胞分泌的胃腸激素,其主要是通過促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、胰島素的合成和分泌,刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化并抑制其凋亡,進(jìn)而保護(hù)β細(xì)胞并增加β細(xì)胞的數(shù)量。近年來,研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還可以在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為IPCs,然而其作用機(jī)制尚未闡明。胃泌素是人體內(nèi)另外一種重要的胃腸激素,其主要是由消化道黏膜中的G細(xì)胞分泌,研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)糖尿病鼠胰腺組織體積增加以及胰島β細(xì)胞數(shù)量的增加。因此,我們推測GLP-1聯(lián)合胃泌素可進(jìn)一步促進(jìn)IPCs分化,且移植后可降低糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠的血糖。為此,本實(shí)驗(yàn)開展以下研究。第一部分大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及腺病毒載體的構(gòu)建目的分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠BMSCs,構(gòu)建p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP腺病毒載體。方法1.大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng):采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)原代大鼠BMSCs,流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠BMSCs表面標(biāo)志物CD34、CD44和CD105,CCK-8測定大鼠BMSCs生長曲線。2.腺病毒載體的構(gòu)建:p Ad Cherry、p Ad EGFP、p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry、和p Ad-Maf A-EGFP腺病毒載體購買于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司,包裝和擴(kuò)增均在293T細(xì)胞,病毒滴度為10-9-10-10/ml,儲(chǔ)存于-80℃冰箱。結(jié)果1.原代大鼠BMSCs培養(yǎng)過程中,細(xì)胞逐漸由圓形透亮變成長梭形,符合大鼠BMSCs形態(tài)特征。流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD34陽性率5%,CD44和CD105陽性率95%,符合大鼠BMSCs表面標(biāo)志特征。2.生長曲線表明細(xì)胞增殖能力良好。腺病毒載體序列符合基因序列。結(jié)論1.體外成功分離大鼠BMSCs。2.p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP腺病毒載體構(gòu)建成功。第二部分體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為IPCs目的Pdx-1、Ngn3聯(lián)合Maf A誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為IPCs,探討GLP-1和Gastrin進(jìn)一步誘導(dǎo)IPCs分化的作用機(jī)制。方法1.腺病毒載體感染大鼠BMSCs:p Ad Cherry和p Ad EGFP分別以MOI5-100感染大鼠BMSCs,觀察熒光及細(xì)胞狀態(tài)確定最佳MOI.p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP以最佳MOI單獨(dú)及聯(lián)合感染大鼠BMSCs,培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基。未感染組作為對照組。2.感染后細(xì)胞鑒定及功能檢測(第一階段):BMSCs分別感染p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry(Pdx-1-Ngn3感染組)、p Ad-Maf A-EGFP(Maf A感染組)、p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP(聯(lián)合感染組),未感染組作為空白對照(未感染組)。蛋白印記(Western blot)檢測感染后細(xì)胞中目的基因的表達(dá);雙硫腙(DTZ)染色鑒定細(xì)胞分泌胰島素的特性;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測感染后細(xì)胞不同時(shí)期胰島素的分泌情況;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測感染后細(xì)胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK(葡萄糖激酶)、Glucagon(胰高血糖素)、insulin2(胰島素基因2)m RNA的表達(dá)。3.GLP-1和Gastrin誘導(dǎo)聯(lián)合感染細(xì)胞及功能分析(第二階段):上述聯(lián)合感染細(xì)胞培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基后7天,分別培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基(聯(lián)合感染組)、高糖培養(yǎng)基含GLP-1(GLP-1誘導(dǎo)組)、Gastrin(Gastrin誘導(dǎo)組)、GLP-1和Gastrin(聯(lián)合誘導(dǎo)組),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測誘導(dǎo)染后細(xì)胞不同時(shí)期胰島素的分泌情況;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK(葡萄糖激酶)、Glucagon(胰高血糖素)、insulin2(胰島素基因2)m RNA的表達(dá)。結(jié)果1.p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP單獨(dú)及聯(lián)合感染的最佳MOI分別為50和30。2.第一階段:Western blot顯示各感染組均有相應(yīng)的蛋白表達(dá),證實(shí)p Ad-Pdx-1-Ngn3-Cherry和p Ad-Maf A-EGFP已成功感染大鼠BMSCs。感染后5天感染組細(xì)胞開始聚集,7天明顯聚集成團(tuán),且可被DTZ染成猩紅色,證實(shí)此時(shí)細(xì)胞已具備IPCs的特征。ELISA結(jié)果顯示各組均有胰島素分泌,聯(lián)合感染組胰島素的分泌水平明顯優(yōu)于其他組,各組在感染第0、3、5、7、9天胰島素分泌水平逐漸提高,且聯(lián)合感染組升高最為明顯(P0.05);RT-PCR結(jié)果顯示與未感染組相比,感染組Pdx-1、Insulin2、Glucagon及GK基因表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05);與Maf A感染組相比,Pdx-1-Ngn3感染組Pdx-1表達(dá)上調(diào),聯(lián)合感染組Pdx-1和Insulin2表達(dá)上調(diào),Glucagon表達(dá)下調(diào)(P0.05);與Pdx-1-Ngn3感染組相比,聯(lián)合感染組Glucagon表達(dá)上調(diào)(P0.05),聯(lián)合感染組GK、Insulin2m RNA的表達(dá)明顯優(yōu)于其他誘導(dǎo)組。3.第二階段:ELISA結(jié)果顯示各組均有胰島素分泌,聯(lián)合誘導(dǎo)組胰島素的分泌水平明顯優(yōu)于其他組,各組在誘導(dǎo)第0、3、5、7天胰島素分泌水平逐漸提高,且聯(lián)合誘導(dǎo)組升高最為明顯(P0.05);RT-PCR結(jié)果顯示:與聯(lián)合感染組相比,GLP-1誘導(dǎo)組GK、Insulin2 m RNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05),聯(lián)合誘導(dǎo)組Pdx-1、GK、Insulin2 m RNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05)。結(jié)論1.Pdx-1-Ngn3聯(lián)合Maf A成功誘導(dǎo)大鼠BMSCs轉(zhuǎn)分化為IPCs。2.GLP-1和Gastrin通過促進(jìn)GK、Pdx-1和insulin2基因的表達(dá)促進(jìn)IPCs的分化及功能的完善。第三部分IPCs移植治療T1DM大鼠目的探討IPCs在體內(nèi)對T1DM大鼠體重及血糖變化的影響及機(jī)制。方法1.T1DM大鼠模型的建立:清潔級SD大鼠,體重220±10g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,禁食12h后,給予腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg。1周后監(jiān)測隨機(jī)血糖,3次隨機(jī)血糖16.7mmol/l則造模成功。2.IPCs移植到T1DM大鼠體內(nèi):采用10%水合氯醛按照0.3ml/100g腹腔注射到大鼠體內(nèi)進(jìn)行麻醉。俯臥位固定大鼠四肢,備皮后左腎區(qū)行長約2cm縱行切口,逐層打開腹腔,將腎臟挑出腹腔,小型鑷子夾起腎臟被膜,微量注射器將制備好的細(xì)胞懸液注射到腎臟下極。25只T1DM大鼠隨機(jī)分成5組,即假手術(shù)組:左腎被膜下移植10ul PBS;移植組A:左腎被膜下移植聯(lián)合感染組細(xì)胞2×106個(gè);移植組B:左腎被膜下移植Gastrin誘導(dǎo)組細(xì)胞2×106個(gè);移植組C:左腎被膜下移植GLP-1誘導(dǎo)組細(xì)胞2×106個(gè);移植組D:左腎被膜下移植聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞2×106個(gè);另外5只正常大鼠左腎被膜下移植10ul PBS作為正常對照組。3.監(jiān)測大鼠體重及空腹血糖變化:移植后,第7,14,21,28天稱量各組大鼠的體重并記錄,禁食12h后,監(jiān)測各組大鼠空腹血糖水平并記錄。4.腹腔糖耐量試驗(yàn):移植后28天,各組大鼠禁食12h,按照每公斤體重0.2g 50%葡萄糖給予腹腔注射,并監(jiān)測注射前及注射后30min,60min,120min血糖。5.腎臟免疫組織化學(xué):行腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)后,切除各組大鼠腎臟組織,固定于4%多聚甲醛用于免疫組化檢測。結(jié)果1.移植后,正常組大鼠體重以每周6-8g增加,而假手術(shù)組大鼠體重以每周3-5g減輕,移植組大鼠體重不但沒有出現(xiàn)明顯的下降,而且有所增加,且以移植組D大鼠體重增加最為顯著。假手術(shù)組大鼠血糖持續(xù)處于高水平,移植組大鼠血糖隨時(shí)間變化均有下降,尤其以移植組D大鼠血糖下降最為明顯。2.腹腔糖耐量試驗(yàn)顯示,正常組大鼠血糖在注射葡萄糖后30min達(dá)高峰,120min時(shí)下降到正常水平;假手術(shù)組大鼠血糖在注射葡萄糖后呈現(xiàn)持續(xù)升高的狀態(tài);移植組大鼠的血糖變化呈現(xiàn)出與正常大鼠相似的先升高再下降的趨勢,但在120min時(shí)并未下降到空腹水平。3.腎臟的免疫熒光顯示,移植組中移植的細(xì)胞可存活并分泌胰島素,且以移植組D細(xì)胞的存活數(shù)量及胰島素分泌水平最為顯著。結(jié)論IPCs移植后不僅可在體內(nèi)存活而且可以分泌胰島素,GLP-1聯(lián)合Gastrin誘導(dǎo)組降糖效果最佳,考慮其機(jī)制為聯(lián)合誘導(dǎo)的IPCs不僅在體內(nèi)的存活的數(shù)量最多,而且分泌胰島素的水平最為顯著。
【關(guān)鍵詞】：胰十二指腸同源盒1 神經(jīng)元素3 V型肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源基因A 胰高血糖素樣肽1 胃泌素 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 胰島樣細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 摘要4-10
• Abstract10-20
• 中英文縮略詞表20-21
• 引言21-23
• 第一部分 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及腺病毒載體的構(gòu)建23-30
• 1 材料23-24
• 2 方法24-26
• 3 結(jié)果26-28
• 4 討論28-29
• 5 結(jié)論29-30
• 第二部分 體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為IPCs30-44
• 1 材料30-32
• 2 方法32-38
• 3 結(jié)果38-43
• 4 討論43
• 5 結(jié)論43-44
• 第三部分IPCs移植治療DM大鼠44-52
• 1 材料44-45
• 2 方法45-47
• 3 結(jié)果47-50
• 4 討論50-51
• 5 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 全文小結(jié)54-55
• 綜述 胰腺轉(zhuǎn)錄因子及胃腸激素對干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞作用研究進(jìn)展55-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 附錄67-77
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文77-78
• 致謝78

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號：1061336