本文關(guān)鍵詞：小鼠鞘內(nèi)注射rAAV9載體介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛轉(zhuǎn)基因表達(dá)

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【摘要】：目的:通過導(dǎo)入治療性基因來治療人類疾病的思想始于二十世紀(jì)七十年代,隨后發(fā)現(xiàn)病毒可作為基因治療的載體。理想的病毒載體必須具備三個(gè)特性:一是對(duì)目標(biāo)組織的高親和性和高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞、組織和器官的低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。二是該病毒載體可以在一段時(shí)間內(nèi)以持續(xù)的、具治療作用的水平表達(dá)。第三也是最重要的,就是病毒載體相關(guān)的副作用如致病性及機(jī)體免疫反應(yīng)最小。腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)是依賴病毒屬細(xì)小病毒科的一種。細(xì)小病毒屬是一種非自主性病毒,需要與其他病毒共同感染以使其表達(dá),并且無致病性,它的這些生物特性大大降低了AAV作為基因治療載體的副作用。重組腺相關(guān)病毒(recombinant AAV,r AAV)因其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫源性低,在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn),被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一,目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究。r AAV能介導(dǎo)目的基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的表達(dá)。r AAV9為r AAV家族中的一員,有研究證實(shí)r AAV9能透過血腦屏障,并在腦和脊髓內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)目的基因,故在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中r AAV9的優(yōu)勢(shì)明顯�；蛑委煹年P(guān)鍵是轉(zhuǎn)基因要被輸送到足夠數(shù)量的疾病受累細(xì)胞中。不同的注射方式所引起的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分布及所需病毒量不同。實(shí)質(zhì)內(nèi)注射可轉(zhuǎn)導(dǎo)注射局部,但對(duì)于病變范圍累及脊髓全長(zhǎng)、腦干及皮層的肌萎縮側(cè)索硬化并不適用。靜脈內(nèi)注射r AAV9雖可轉(zhuǎn)導(dǎo)新生小鼠CNS的廣泛區(qū)域,但對(duì)成年小鼠CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低,且存在靶向性不強(qiáng)、載體需求量大及潛在的安全性問題。腦脊液內(nèi)注射r AAV載體沒有血腦屏障的阻礙,直接與CNS接觸。主要途徑包括腦室內(nèi)注射、小腦延髓池注射和鞘內(nèi)注射,其中鞘內(nèi)注射對(duì)脊髓的轉(zhuǎn)導(dǎo)更具優(yōu)勢(shì),是沒有創(chuàng)傷的基因治療給藥方法。有研究者應(yīng)用小鼠鞘內(nèi)置管注射或直接腰椎穿刺的方法研究了r AAV載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá),但存在的共同問題是不同個(gè)體間轉(zhuǎn)導(dǎo)程度和范圍變異較大,作者認(rèn)為與操作者置管及注射成功與否的不確定性有關(guān)。直接腰穿鞘內(nèi)注射相對(duì)于鞘內(nèi)置管更安全、無創(chuàng)且簡(jiǎn)便可行,但同時(shí)存在小動(dòng)物固有的技術(shù)難度。操作者直接鞘內(nèi)注射的成功程度不同將導(dǎo)致個(gè)體間轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及臨床效果的巨大差異。因此,需要一種無創(chuàng)、簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)的廣泛CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)小鼠腰椎穿刺鞘內(nèi)注射的盲目性,建立了對(duì)鞘內(nèi)注射效果的簡(jiǎn)單、有效的即時(shí)評(píng)估系統(tǒng)。利用改良的小鼠直接鞘內(nèi)注射法將r AAV9-CB6-EGFP注射入椎大池部位的腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)中,研究r AAV9載體介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)范圍、效率及細(xì)胞類型。方法:1小鼠鞘內(nèi)注射法雄性8-10周齡FVB小鼠18只,分為對(duì)照組6只及實(shí)驗(yàn)組12只。小鼠清醒狀態(tài)下分別腰椎穿刺法注射PBS或r AAV9-CB6-EGFP載體(4x1010GC)8ul(含1%利多卡因),記錄注射后小鼠四肢無力及癱瘓情況,三周后新鮮或4%多聚甲醛灌流固定取材。2免疫組織化學(xué)法4%多聚甲醛固定的腦和脊髓組織經(jīng)振動(dòng)切片機(jī)切成厚20μm切片,0.01M PBS溶液漂洗;3%H2O2浸泡,封閉組織內(nèi)源性過氧化物酶;0.3%triton X-100穿孔;10%馬血清室溫封閉,分別加入抗GFP、抗GFAP及抗Iba1抗體,二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素依次孵育后,DAB染色,撈片,脫水,透明及封片。Olympus BX51顯微鏡觀察及照相。3免疫熒光法4%多聚甲醛固定的脊髓組織經(jīng)30%蔗糖/PBS溶液浸泡過夜至組織沉底。冷凍環(huán)境下使用包埋劑OCT包埋組織,用冰凍切片機(jī)切成厚20μm切片,經(jīng)漂洗、穿孔、封閉、一抗(anti-GFP,anti-Neu N,anti-GFAP,anti-Iba1和anti-APC)、熒光二抗孵育并再次PBS漂洗后,抗熒光衰減封片劑封片,Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察及照相。4蛋白免疫印跡小鼠經(jīng)麻醉后,新鮮取腰髓、頸髓、腦干、小腦、海馬、皮層和嗅球,液氮速凍后,-80℃保存待用。提取組織總蛋白,BCA法測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣30ug,SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫脫脂奶粉封閉后,分別加一抗4℃搖床過夜。次日,加入熒光二抗,洗膜,Odyssey紅外掃描成像系統(tǒng)掃膜并分析結(jié)果。5統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料用x±s表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。不同部位表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析。P0.05為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1根據(jù)小鼠鞘內(nèi)注射后短暫肌無力表現(xiàn)分為5級(jí):1分,雙后肢輕度無力。2分,雙后肢中度無力,伴步態(tài)異常。3分,雙后肢癱瘓。4分,雙后肢癱瘓伴雙前肢無力。5分,四肢癱瘓伴呼吸受抑。評(píng)分4-5分為注射成功。18只注射的小鼠中有14只注射成功,成功率為77.8%。2鞘內(nèi)注射PBS組小鼠脊髓GFP免疫組織化學(xué)染色呈陰性,r AAV9載體注射組小鼠脊髓GFP免疫組化染色呈不同程度陽(yáng)性,與注射后短暫肌無力評(píng)分呈明顯正相關(guān)。成功注射的小鼠脊髓GFP表達(dá)明顯強(qiáng)于注射失敗小鼠,因此通過注射后肌無力表現(xiàn)能預(yù)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。3小鼠鞘內(nèi)注射r AAV9載體后,脊髓全長(zhǎng)均有轉(zhuǎn)基因表達(dá),以前角、后角、前根發(fā)出區(qū)及后根傳入?yún)^(qū)域?yàn)橹ＤX干、小腦及前腦均可見不同程度、散在的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。GFP陽(yáng)性細(xì)胞以膠質(zhì)細(xì)胞為主,可見脊髓前角神經(jīng)元、小腦蒲肯野細(xì)胞、皮層及海馬神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。4免疫熒光顯示神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞均存在GFP表達(dá)。5免疫印跡顯示GFP在腰髓表達(dá)最高,其次是頸髓、嗅球、海馬和皮質(zhì),腦干和小腦轉(zhuǎn)基因表達(dá)較低。6成功轉(zhuǎn)導(dǎo)r AAV9載體的小鼠腰髓未見明顯小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生,與對(duì)照組相比無明顯差異。結(jié)論:小鼠鞘內(nèi)注射r AAV載體簡(jiǎn)便、無創(chuàng),通過加入利多卡因可有效地預(yù)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率;r AAV9載體經(jīng)腰椎穿刺注入CSF后,在脊髓全長(zhǎng)及腦組織內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)范圍廣泛,且不引起明顯的神經(jīng)炎性反應(yīng),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中具有潛在的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：rAAV9 腰椎穿刺 鞘內(nèi)注射 基因治療 中樞神經(jīng)系統(tǒng) 免疫反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R450
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文縮寫12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-23
• 附圖23-28
• 討論28-30
• 結(jié)論30
• 參考文獻(xiàn)30-33
• 綜述 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化基因治療 的研究進(jìn)展33-44
• 參考文獻(xiàn)39-44
• 致謝44-45
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷45

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1 楊輝;向錢;李寧;;食品中轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白的危險(xiǎn)性評(píng)估[J];中國(guó)食品衛(wèi)生雜志;2010年02期

2 康禹,高占成,虞有志,尚穎,何俊里,張一,何權(quán)瀛;腺病毒介導(dǎo)的β-半乳糖苷酶在小鼠氣道上皮的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊;2001年06期

3 孫漢堂;肖明振;吳補(bǔ)領(lǐng);朱慶林;費(fèi)儉;;牙本質(zhì)涎蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的初步分析[J];上海口腔醫(yī)學(xué);2006年02期

4 余惠明,王天云;人β-珠蛋白MAR對(duì)轉(zhuǎn)基因在不同細(xì)胞中表達(dá)的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年14期

5 徐東平;吳易元;陳金棟;遇瓏;鐘梅;惠依群;翟紅;;入 IL-2轉(zhuǎn)基因表達(dá)及對(duì)小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)的影響[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1993年01期

6 王天云;韓忠敏;楊獻(xiàn)軍;董忠生;王清義;;MAR提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2008年11期

7 陳漢源;控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的細(xì)胞和時(shí)序?qū)Ｒ恍訹J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1997年02期

8 劉惠彬,江一平;轉(zhuǎn)基因表達(dá)的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年01期

9 孫敬方;時(shí)空表達(dá)可控的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型調(diào)控體系的研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào);2005年02期

10 胡萍;高占成;;mIFN-γ轉(zhuǎn)基因表達(dá)對(duì)小鼠肺纖維化治療的作用機(jī)制[J];山東醫(yī)藥;2009年28期

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1 張蕾;程巳雪;張先正;卓仁禧;;以聚丙三醇為核枝接PEI的高支化聚合物實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)基因表達(dá)[A];全國(guó)博士后微納米粉體與材料應(yīng)用技術(shù)交流會(huì)論文集[C];2009年

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1 張石盼;小鼠鞘內(nèi)注射rAAV9載體介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛轉(zhuǎn)基因表達(dá)[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 馮婧嫻;人工核酶核糖開關(guān)調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的性能及優(yōu)化[D];華僑大學(xué);2015年

3 鄭嫻嫻;輔助病毒依賴型腺病毒載體轉(zhuǎn)基因的體外表達(dá)效率[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

4 劉惠彬;CMV-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及轉(zhuǎn)基因表達(dá)情況的觀察[D];福建醫(yī)科大學(xué);2005年

5 牛衛(wèi)品;線蟲特定神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：1049607