本文關鍵詞：p38MAPK在腦缺血再灌注損傷中的作用研究

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【摘要】：全腦缺血在臨床上很常見,多表現(xiàn)為心肌梗死、休克、窒息等癥狀造成的腦部血液低灌流。腦缺血再灌注損傷指腦缺血后腦細胞被損傷,恢復血液再灌注后,不僅不能使組織器官功能恢復,反而其缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷在許多重要器官包括心、腦、肝、肺、腎、胃腸道等均可發(fā)生。腦缺血損傷范圍廣泛,如海馬等缺血損傷敏感區(qū)易發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。海馬與情緒、內臟活動、近期記憶的形成有關,因此,以鼠腦缺血再灌流模型模擬人類腦血管病進行研究也顯得尤為重要。近幾年來,缺血性腦血管病發(fā)病率的有逐年上升的趨勢,相關動物模型的構建也受到了廣泛的關注。雙側頸總動脈夾閉法因其操作簡單、損傷較小、動物死亡率低、模型成功率高和缺血再灌注時間易于控制,且能很好模擬人類腦梗塞再灌時腦組織病理生理的演變過程等優(yōu)點倍受研究者們的青睞。腦缺血/再灌注損傷是多種機制參與的一種復雜的病理生理過程,多種環(huán)節(jié)因素之間又發(fā)生互相作用。神經(jīng)元凋亡是損傷后的最常見形式之一,凋亡過程又受基因所調控。p38 MAPK可參與細胞生長、增殖、分化、死亡及細胞間的功能同步等多種生理過程。腦缺血神經(jīng)元損傷后,早期p38 MAPK被激活進而缺血區(qū)的膠質細胞和神經(jīng)元表達增加,并表現(xiàn)出時間的相關性,提示p38 MAPK信號通路在腦缺血神經(jīng)元死亡過程中起著重要的調控作用。因此,在信號通路水平阻斷和調控p38 MAPK的表達和活性可能成為治療缺血型腦卒中的新的途徑之一�；诖�,我們將建立全腦缺血再灌注小鼠模型,觀察全腦缺血再灌注后p38MAPK表達的變化及神經(jīng)元凋亡的情況,旨在探討缺血致神經(jīng)元凋亡的機制,并觀察p38 MAPK抑制對缺血受損神經(jīng)元的保護作用,以期為臨床腦缺血損傷后的治療提供實驗指導。本課題研究內容分以下三部分。第一部分、小鼠腦缺血再灌注模型的建立第二部分、腦缺血再灌注后p38MAPK的表達變化研究第三部分、抑制p38MAPK在腦缺血再灌注損傷中的作用研究第一部分：小鼠腦缺血再灌注模型的建立[目的]飼養(yǎng)小鼠,小鼠基因型鑒定,建立全腦缺血再灌注模型,觀察存活率。[方法](1)在SPF級動物房飼養(yǎng)小鼠,取小鼠鼠尾提取DNA,經(jīng)PCR擴增、凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)圖像采集后確定小鼠基因型,鑒定需要的小鼠基因型,進行分類并規(guī)模繁殖。(2)應用BCCAO法(bilateral common carotid artery occlusion)制作小鼠全腦缺血再灌注模型,其具體步驟如下：各組小鼠鼠術前禁食12h,禁飲4h,以1%戊巴必妥鈉溶液腹腔注射麻醉小鼠,80mg/kg體重,注射麻醉后注意密切觀察實驗小鼠的自主呼吸,等待翻正反射消失后,仰臥位固定于自制的鼠板上,在解剖顯微鏡下進行操作,沿著頸部中線正中切開,鈍性分離肌肉及結締組織,分離出雙側頸總動脈并埋線,操作過程避免損傷迷走神經(jīng),用無菌絲線依次結扎雙側頸總動脈,觀察小鼠的生命體征,如小鼠的呼吸和心跳正常,20mmin再灌注后即可縫合各層肌肉和皮膚,手術創(chuàng)口噴灑并術后肌注慶大霉素預防感染,術中用電熱取暖器,以保持體溫,術后單籠飼養(yǎng)防止交叉感染。假手術組只分離肌肉及結締組織,暴露雙側頸總動脈后縫合切口。(3)各組實驗小鼠處理后,統(tǒng)計各組的存活率,制作存活率曲線。[結果](1)PCR擴增產物電泳,用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測拍照。對照DNAmarker有328bp、195bp兩條條帶的為轉基因p38KI/+小鼠,僅有195bp條帶的為野生型C57BL/6小鼠(WT),參照基因鑒定結果進行小鼠分籠,單獨飼養(yǎng)。(2)缺血再灌注模型制備后的一般情況。假手術組：術后幾天恢復后小鼠精神狀態(tài)好,自主活動多,行動敏捷,各種反應迅速,進食飲水正常。缺血再灌注模型組：小鼠術后多數(shù)精神萎靡,反應遲鈍,活動量減少,進食進水量也明顯減少,行動遲緩；小部分小鼠會出現(xiàn)活動增多,煩躁不安,行走不穩(wěn)等表現(xiàn),而且小鼠的自潔能力下降,毛發(fā)變稀疏、干枯、豎毛或是缺乏光澤度,偶見有小鼠短暫性陣發(fā)性驚厥發(fā)作。(3)SHAM組小鼠存活率100%,轉基因p38KI/+小鼠生存率較WT小鼠缺血再灌注模型組有所提高。[結論]利用PCR成功鑒定了轉基因小鼠的基因型,利用BCCAO法制作I/R模型,并表現(xiàn)了一些癥狀。基因型小鼠的獲得,全腦缺血再灌注后小鼠損傷。第二部分：腦缺血再灌注后p38MAPK的表達變化研究[目的]建立小鼠全腦腦缺血再灌注模型,觀察損傷后p38 MAPK在不同時間的表達變化及對應時間點凋亡相關蛋白的表達變化,同時在不同時間點進行神經(jīng)功能缺損研究和組織形態(tài)學研究,以進一步確定研究內容和時段的變化情況。[方法](1)應用兩血管法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)建立小鼠全腦缺血再灌注模型,將約三月齡雄性鼠隨機分成假手術組、缺血再灌注模型組(I/R組),應用蛋白印跡Western blot)法檢測小鼠海馬區(qū)p38MAPK磷酸化水平變化。確定變化時間點后進行p-p38和c-caspase-3表達變化研究。(2)小鼠進行BCCAO造模后,分別在1d、3d、5d等幾個時間點進行TTC染色,觀察缺血情況。計算缺血面積比和梗死體積比。(3)再灌注后NDS評分并采用改良NSS評分法(18分制)對小鼠造模1d,3d,5d,7d后的進行神經(jīng)功能缺損評估。用美國弗尼吉亞評分法在造模3d前對小鼠進行訓練,缺血前1h記錄基礎值,造模后1d、3d評分,分別測兩次記錄時間,取均值。(4)取雄性C57小鼠隨機分為3組,每組各6只,造模后,分別于造模后1d和3d進行生理鹽水、多聚甲醛灌注后取腦,切片后用TUNEL染色法計算缺血再灌注組海馬CA1區(qū)凋亡的陽性細胞數(shù)并計算凋亡指數(shù),分析凋亡指數(shù)的變化情況。[結果](1)經(jīng)western blot分析,發(fā)現(xiàn)3d實驗組分別比1d、5d和7d實驗組后p38蛋白的表達量較高。進而選取3d時間點進行研究,得知I/R模型組p-p38蛋白和SHAM組相比表達升高(p0.05)。I/R模型組c-caspase-3和SHAM相比表達升高(p0.05)。(2)與SHAM組相比,1d(55.344±3.325,p0.05)比3d(44.047±2.099)和5d(34.985±5.435)的梗死體積比更大,缺血相對嚴重。(3)腦卒中指數(shù)NDS評分中,I/R模型組比SHAM組分值高。改良NSS評分中模型組1d、3d、5d和7d比SHAM組分值高。弗吉尼亞評分法中,與SHAM組相比,模型組分值高,有顯著差異(p0.05)。(4)TUNEL染色后,模型組3d后CA1區(qū)凋亡指數(shù)與SHAM組有顯著差異(p0.05),但1d后CA1區(qū)的凋亡指數(shù)與SHAM無顯著差異(p0.05).[結論]小鼠腦缺血再灌注3d后相關蛋白因子p38表達量明顯升高,相應凋亡蛋白因子caspase3升高,出現(xiàn)凋亡。TUNEL染色結果表明實驗組3d后發(fā)生了明顯細胞凋亡。TTC染色1d后缺血梗死體積最顯著。NDS評分結果、NSS評分和弗吉尼亞評分法評分結果一致,實驗組與SHAM組差異明顯。表明腦缺血再灌注后小鼠神經(jīng)功能發(fā)生了缺損。第三部分：抑制p38MAPK在腦缺血再灌注損傷中的作用研究[目的]探討p38MAPK抑制在腦缺血再灌注中的保護作用。[方法](1)將三月齡雄性C57小鼠隨機分成假手術組、I/R模型組,加入轉基因p38KI/+小鼠全腦缺血造模后做為I/R+KI模型組,應用兩血管法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)建立全腦缺血模型。應用蛋白印跡(Western blot)法檢測小鼠海馬區(qū)p38 MAPK(p-p38/p38)磷酸化水平變化及凋亡蛋白caspase-3表達(c-caspase3/caspase3)變化情況。(2)小鼠進行BCCAO造模后,在1d進行TTC染色,觀察缺血情況計算缺血面積和梗死體積。(3)造模后NDS評分(25分制)并采用改良NSS評分(18分制)對小鼠造模Id,3d,5d,7d后的情況進行評估。用美國弗尼吉亞評分法在造模3d前對小鼠進行訓練,缺血前1h記錄基礎值,造模后1d、3d評分,分別測兩次記錄時間,取均值。(4)取雄性C57小鼠和轉基因p38KI/+小鼠隨機分為3組,每組各6只。取雄性C57小鼠和轉基因p38KI/+小鼠各5只造模后,分別于造模后72h進行生理鹽水、多聚甲醛灌注后取腦,用TUNEL染色法計算各組海馬CA1區(qū)凋亡的陽性細胞數(shù),并計算凋亡指數(shù)。[結果] (1)/R+KI模型組和假手術組、I/R模型組相比p38MAPK表達(p-p38/p38)均降低,均有顯著差異(p0.05)。I/R+KI模型組和I/R模型組相比caspase-3表達(c-caspase3/caspase3)降低,有顯著差異(p0.05)。(2)I/R模型組和I/R+KI模型組相比TTC梗死體積減少,有顯著差異(p0.05)。(3)腦卒中指數(shù)評分中,I/R模型組(12±1.414)比I/R+KI模型組(7.75±1.500)分值高。改良NSS評分對假手術組、I/R模型組和I/R+KI模型組進行評分。I/R模型組1d、3d、5d和7d比I/R+KI模型組、3d、5d和7d分值高,有顯著差異(p0.05)。弗吉尼亞評分法中,I/R模型組比I/R+KI模型組分值高,差異顯著(p0.05)。(4)TUNEL染色后SHAM組海馬細胞核膜完整,核仁清楚,偶可見退變錐體細胞,而I/R模型組和I/R+KI模型組核膜解體,染色質濃縮、邊緣化,胞膜有小泡狀形成、染色質分割成塊狀等,I/R模型組3d后CA1區(qū)凋亡的陽性細胞數(shù)和凋亡指數(shù)與I/R+KI模型組有顯著差異,(p0.05)。[結論]I/R+KI模型組和I/R模型組相比,p38MAPK抑制后蛋白表達降低,凋亡相關蛋白caspase3表達降低。TUNEL染色結果表明I/R+KI模型組細胞凋亡和I/R模型組相比明顯減少。I/R+KI模型組TTC梗死體積減少。改良的神經(jīng)功能評分、NSS評分和弗吉尼亞評分法結果一致。說明p38 MAPK被抑制后,神經(jīng)功能得到修復,有保護作用。
【關鍵詞】：轉基因小鼠鑒定 小鼠全腦缺血再灌注損傷 存活率曲線 p-p38 c-caspase-3 TTC 梗死體積 行為學評分 TUNEL 轉基因p38~(KI/+)小鼠 p-p38表達 行為學 凋亡 保護作用
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743
【目錄】：

• 縮略詞表(以字母順序排列)6-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-19
• 第一部分、小鼠腦缺血再灌注模型的建立19-35
• 前言19-20
• 材料與方法20-24
• 結果24-25
• 討論25-30
• 參考文獻30-35
• 第二部分、腦缺血再灌注后p38MAPK的表達變化研究35-62
• 前言35-36
• 材料與方法36-46
• 結果46-51
• 討論51-55
• 參考文獻55-62
• 第三部分、抑制p38MAPK在腦缺血再灌注損傷中的作用研究62-84
• 前言62-63
• 材料與方法63-70
• 結果70-76
• 討論76-79
• 參考文獻79-84
• 全文總結84-85
• 綜述85-95
• 參考文獻92-95
• 本課題獲以下基金支持95-96
• 攻讀學位期間獲得的學術成果96-97
• 致謝97

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本文編號：1000907