發(fā)布時(shí)間：2017-09-14 00:25

  本文關(guān)鍵詞：基于細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建無(wú)支架組織工程血管化骨的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 組織工程骨 細(xì)胞膜片預(yù)血管化

【摘要】：目的：探討完全利用原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells BMSCs)體外構(gòu)建無(wú)支架組織工程血管化骨,并用于修復(fù)大鼠顱骨臨界骨缺損的可行性。方法：(1)BMSCs的體外培養(yǎng)與生長(zhǎng)特性的觀察：全骨髓貼壁法分離,培養(yǎng),純化BMSCs,利用倒置顯微鏡觀察其生長(zhǎng)特性并拍照。(2)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化：將第2代純化的BMSCs采用內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)14天,倒置顯微鏡觀察其生長(zhǎng)特性,并通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定誘導(dǎo)形成的內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells ECs)。(3)預(yù)血管化膜片的構(gòu)建：將第2代純化的BMSCs以9×104/cm2的密度接種于六孔板,并在體外連續(xù)培養(yǎng)2周形成未分化膜片,將誘導(dǎo)形成的ECs細(xì)胞以5×104/cm2的密度均勻接種于未分化膜片,在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天,倒置相差顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞在未分化膜片上的分布情況。(4)三維血管化無(wú)支架組織工程骨的構(gòu)建：通過(guò)細(xì)胞刮刀刮取預(yù)血管化膜片,利用鑷子將完整的預(yù)血管化膜片提起并平鋪到成骨細(xì)胞膜片表面,通過(guò)成骨細(xì)胞膜片卷曲包裹預(yù)血管化膜片,形成三維血管化復(fù)合膜片,作為實(shí)驗(yàn)組；將未分化膜片平鋪到成骨細(xì)胞膜片表面,通過(guò)成骨細(xì)胞膜片卷曲包裹未分化膜片,形成三維復(fù)合膜片,作為對(duì)照組。(5)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組膜片用于修復(fù)大鼠顱骨缺損：利用牙科鉆制取直徑8mmm的大鼠顱骨全層圓形缺損,并將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組復(fù)合膜片植入顱骨缺損處。并于術(shù)后2周、4周、8周通過(guò)大體觀察、HE染色、CD-31染色、X線檢測(cè)、Van Gieson染色及Trap染色檢測(cè)植入膜片的成血管和成骨能力。結(jié)果：(1)我們成功地培養(yǎng)出了大鼠BMSCs,該細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,多克隆樣生長(zhǎng)(2)純化的BMSCs(?)在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液中向ECs誘導(dǎo)分化,鏡下可見(jiàn)誘導(dǎo)形成的ECs呈典型的“鋪路石”樣生長(zhǎng)方式生長(zhǎng),流式細(xì)胞檢測(cè)顯示大約有38%的細(xì)胞表達(dá)CD-31陽(yáng)性。(3)進(jìn)一步將誘導(dǎo)形成的ECs均勻的接種至未分化膜片上,3天后,倒置相差顯微鏡以及CD-31免疫熒光染色顯示在其表面有空泡樣結(jié)構(gòu)的形成。(4)術(shù)后2周,HE染色和CD-31免疫組化染色顯示,實(shí)驗(yàn)組新生的血管較對(duì)照組顯著增多,術(shù)后4周和8周,通過(guò)HE和van-Gieson染色顯示,實(shí)驗(yàn)組新骨形成量明顯較對(duì)照組多,并且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的破骨細(xì)胞染色結(jié)果均呈陽(yáng)性。結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)全骨髓貼壁法能夠獲取較純的大鼠BMSCs,較之于其他實(shí)驗(yàn)方法,該方法更方便,且費(fèi)用較低。(2)通過(guò)培養(yǎng)基中加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor b-FGF)能夠誘導(dǎo)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞分化,并且,誘導(dǎo)形成的ECs不管在形態(tài)和特征上都與內(nèi)皮細(xì)胞相似。(3)在未分化膜片上接種BMSCs誘導(dǎo)形成的ECs,體外能夠構(gòu)建出預(yù)血管化膜片。(4)體外構(gòu)建的復(fù)合膜片植入大鼠顱骨缺損區(qū)能形成大量與宿主血管吻合良好的毛細(xì)血管,同時(shí)有新生骨組織的形成,較之于無(wú)血管化三維復(fù)合膜片,有效修復(fù)了大鼠顱骨臨界骨缺損。本實(shí)驗(yàn)為無(wú)支架組織工程骨的構(gòu)建提供了一個(gè)新的策略。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 組織工程骨 細(xì)胞膜片預(yù)血管化
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R782.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 附錄7-10
• 前言10-12
• 文獻(xiàn)回顧12-17
• 一 BMSCs向ECs誘導(dǎo)的研究現(xiàn)狀12-13
• 二 細(xì)胞膜片技術(shù)的機(jī)制原理13
• 三 利用細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建組織工程骨的研究現(xiàn)狀13-15
• 四 細(xì)胞膜片作為仿生骨膜,促進(jìn)骨缺損的修復(fù)15
• 五 細(xì)胞膜片在組織工程血管化領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀15-17
• 實(shí)驗(yàn)一 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外培養(yǎng)與干細(xì)胞膜片的構(gòu)建17-25
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料17-18
• 2 實(shí)驗(yàn)方法18-20
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-22
• 4 實(shí)驗(yàn)討論22-25
• 實(shí)驗(yàn)二 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)血管化膜片構(gòu)建25-31
• 1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-29
• 4 實(shí)驗(yàn)討論29-31
• 實(shí)驗(yàn)三 基于細(xì)胞膜片構(gòu)建無(wú)支架組織工程血管化骨修復(fù)大鼠顱骨臨界極限缺損31-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 2 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-39
• 4 討論39-40
• 5 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 病例匯報(bào)46-52
• 研究生期間的研究成果52-53
• 致謝53

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