本文關(guān)鍵詞：變異鏈球菌中抗壞血酸特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)相關(guān)基因的初步研究

  更多相關(guān)文章： 變異鏈球菌 ptxA基因 ptxB基因 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) 抗壞血酸

【摘要】：研究背景及目的齲病是危害人類口腔健康最常見的疾病,目前較為公認(rèn)的致齲菌之一是變異鏈球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)。 S. mutans可通過代謝碳水化合物,從而發(fā)揮產(chǎn)酸、耐酸、黏附、合成胞外多糖、形成生物膜等與致齲相關(guān)的生物學(xué)特性。通過對S. mutans UA159全基因組測序的分析表明,S. mutans有15%的基因與碳水化合物的代謝有關(guān),呈現(xiàn)出強大的碳水化合物代謝能力。S. mutans可以多種方式吸收轉(zhuǎn)運碳水化合物,但最主要、轉(zhuǎn)運效率最高的方式為磷酸烯醇式丙酮酸：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphoenolpyruvate-dependent:phosphotransferase system, PTS)。PTS一般由三部分組成,分別為酶I(enzyme Ⅰ, EI)、含組氨酸的磷酸載體蛋白(histidine-containing phosphocarrier protein, HPr),以及酶I1(enzyme Ⅱ.ElI)復(fù)合體。其中EI和HPr不具有底物特異性,而ElI復(fù)合體具有底物特異性,一般由IIA、1IB和IIC三個結(jié)構(gòu)域組成,負(fù)責(zé)對特定底物的磷酸化及跨膜轉(zhuǎn)運。由于PTS在碳水化合物的轉(zhuǎn)運代謝中發(fā)揮著重要作用,關(guān)于PTS的研究受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注。目前已有學(xué)者針對S. mutans特異性轉(zhuǎn)運葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇的PTS展開研究,但尚未有關(guān)于S. mutans抗壞血酸特異性PTS的研究。ptxA基因(NCBI GeneID:1027857)與ptxB基因(NCBI GeneID:1027854)分別編碼S. mutans UA159 PTS中抗壞血酸家族EII復(fù)合體中的EIIA和EIIB。有學(xué)者曾經(jīng)對PtxA、PtxB蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,并進(jìn)行體外酶活性實驗研究,發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白對抗壞血酸的磷酸化具有特異性,并推斷PtxA、PtxB蛋白應(yīng)與S. mutans對抗壞血酸的轉(zhuǎn)運有關(guān)�？箟难嵩谧匀唤缰蟹植紡V泛,尤其在水果及蔬菜中含量豐富。研究發(fā)現(xiàn),許多細(xì)菌均可在無氧條件下發(fā)酵抗壞血酸,以獲得維持生命活動的碳源,如大腸桿菌、乳酸桿菌、肺炎桿菌等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),S. mutans亦可在厭氧環(huán)境中發(fā)酵抗壞血酸,以維持生存。而如果敲除S. mutans的ptxA基因,其抗壞血酸的代謝將出現(xiàn)障礙,ptxA基因缺陷的S. mutans在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸、形成生物膜能力均受到明顯影響。鑒于ptxA基因在S. mutans抗壞血酸代謝中發(fā)揮的重要作用,為了探究ptxA基因上游的ptxB基因是否也發(fā)揮著類似的作用,并明確它們之間的關(guān)系,本研究擬構(gòu)建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因雙重缺陷菌株,及其功能補償菌株,研究上述缺陷菌株和補償菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸、耐酸、合成胞外多糖及形成生物膜的能力,明確ptxA、ptxB基因?qū). mutans生物學(xué)特性的影響。此外,對ptxA、ptxB基因及其鄰近基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析,以加深對S. mutans抗壞血酸特異性PTS的理解。第一章變異鏈球菌ptxA、ptxB基因缺陷菌株及其功能補償菌株的構(gòu)建目的：構(gòu)建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因雙重缺陷菌株,并另外構(gòu)建ptxA功能補償菌株、ptxB功能補償菌株和ptxA、ptxB功能補償菌株,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法：根據(jù)S. mutans UA159全基因組的序列,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計目的基因的上下游引物,并PCR擴增上下游片段。以pFW5質(zhì)粒為載體,通過雙酶切,將上下游片段插入至質(zhì)粒的兩個多克隆位點中,構(gòu)建目的基因缺陷的重組質(zhì)粒。而后,在感受態(tài)刺激肽的作用下,將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入野生型S. mutansUA159中,構(gòu)建基因缺陷菌株。利用類似方法,以pDL278質(zhì)粒為載體,構(gòu)建功能補償質(zhì)粒,而后轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的基因缺陷菌株中,構(gòu)建功能補償菌株。結(jié)果：經(jīng)過PCR鑒定和測序鑒定,ptxB缺陷菌株(ptxB-)、ptxAB雙重基因缺陷菌株(ptxAB-)、ptxA功能補償菌株(CptxA-)、ptxB功能補償菌株(CptxB-)和ptxAB功能補償菌株(CptxAB-)構(gòu)建成功。第二章變異鏈球菌ptxA、ptxB基因?qū)ζ渖飳W(xué)特性的影響目的：研究S.mutans UA159、ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptxA-菌株、CptxB-菌株、CptxAB-菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力,明確ptxA.ptxB基因?qū). mutans生物學(xué)特性的影響。方法：1.配制抗壞血酸特異性培養(yǎng)基。采用胰蛋白胨-維生素培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加濃度為15 mmol/L的抗壞血酸,以提供S.mutans生長所需的碳源。2.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長情況。將S. mutans UA159、 ptxA-菌株、ptxB-菌株、ptxAB-菌株、CptaxA-菌株、CptxB-菌株、CptxAB-菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)72 h。期間每隔2 h測量各菌液的OD600值,繪制各菌株的生長曲線。3.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中作為實驗組,對照組加入至BHI培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)前、培養(yǎng)24 h后及培養(yǎng)48 h后分別測量各培養(yǎng)基的pH值,計算各菌株培養(yǎng)前后的△pH值。4.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的耐酸能力。將7種菌株置于抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)至OD600≈0.3,離心,收集菌胞,加入至pH 5.0的抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中,37℃厭氧孵育1 h進(jìn)行酸適應(yīng)。而后,采用0.1mol/L,pH 7.0的甘氨酸溶液洗滌,0.1 mol/L,pH 2.8的甘氨酸溶液重懸,并靜置0,15,30,45 min,對細(xì)菌進(jìn)行酸沖擊。隨后,將菌液進(jìn)行梯度稀釋,涂板,37℃厭氧培養(yǎng)48h后觀察平板上的菌落數(shù)。5.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生物膜形成能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中,并轉(zhuǎn)移至已放置好無菌蓋玻片的六孔板中,37℃厭氧培養(yǎng)120 h。經(jīng)過洗滌、干燥,使用SYTO9對細(xì)菌形成的生物膜進(jìn)行染色,激光共聚焦顯微鏡觀察,隨機選擇5個視野進(jìn)行拍照。使用Image J軟件對所有照片進(jìn)行分析,計算生物膜平均的覆蓋面積。6.探究各菌株在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的胞外多糖合成能力。將7種菌株分別加入至抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中,并轉(zhuǎn)移至已放置好無菌蓋玻片的六孔板中,37℃厭氧培養(yǎng)120 h。經(jīng)過洗滌、干燥,使用Calcofluor White對細(xì)菌合成的胞外多糖進(jìn)行染色,激光共聚焦顯微鏡觀察。7.統(tǒng)計學(xué)分析。采用SPSS 20.0軟件對耐酸實驗的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用單因素方差分析的方法,P0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果：1.與野生型S. mutans UA159相比,缺陷株的生長能力受到明顯影響。ptxA缺陷菌株的遲緩期延長,其終末菌密度降低。ptxB缺陷菌株與ptxAB雙重基因缺陷菌株在監(jiān)測的72 h內(nèi)未見明顯增長。ptxA功能補償菌株和ptxAB功能補償菌株可在一定程度上補償缺陷菌株的生長能力,但仍未達(dá)到野生株的水平。而ptxB功能補償菌株無法對缺陷菌株的生長能力進(jìn)行補償。2.野生株、缺陷株和補償株在BHI培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力相同,而在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中不同。培養(yǎng)24 h后,野生株UA159培養(yǎng)基的pH值輕微下降,而三種缺陷菌株培養(yǎng)基的pH值基本不變,與野生株相比,△pH的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ptxA、ptxAB功能補償菌株可在一定程度上補償缺陷菌株的產(chǎn)酸能力,但ptxB功能補償菌株卻無法對此進(jìn)行補償。在培養(yǎng)48 h后,各菌株培養(yǎng)基的pH值進(jìn)一步下降,且野生株和缺陷株在產(chǎn)酸能力上的差異更加明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.經(jīng)過1 h pH 5.0的酸適應(yīng)和15 min pH 2.8的酸沖擊后,三種缺陷菌均無法在瓊脂平板上長出。4.經(jīng)SYT09染色的細(xì)菌生物膜呈現(xiàn)綠色。野生株UA159形成的生物膜較為致密,細(xì)菌團塊較大,遍布整個視野,覆蓋面積為65.93%。ptxA基因缺陷菌株所形成的生物膜較野生型稀疏,呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),存在不規(guī)則圓形或橢圓形大小不一的孔隙,覆蓋面積僅為39.61%。ptxB、ptxAB基因缺陷菌株無法形成具有三維結(jié)構(gòu)的生物膜,細(xì)菌呈短鏈狀排列,散在分布,覆蓋面積分別為24.24%和18.57%。ptxA、ptxAB功能補償菌株形成的生物膜與野生株相似,但孔隙較大,而ptxB功能補償菌株無法恢復(fù)至野生株的水平。5.經(jīng)Calcofluor White染色的細(xì)菌胞外多糖呈現(xiàn)藍(lán)色。各菌株合成胞外多糖的情況與其形成生物膜的情況類似,胞外多糖的分布與生物膜的分布基本一致。ptxA、ptxB、ptxAB基因缺陷菌株所合成的胞外多糖較野生株明顯減少。結(jié)論：1. S. mutans的ptxA、ptxB基因與抗壞血酸的轉(zhuǎn)運代謝密切相關(guān)。2. ptxA、ptxB基因的缺陷可影響S. mutans在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中的生長、產(chǎn)酸、耐酸、胞外多糖合成及生物膜形成能力。第三章變異鏈球菌ptxA、ptxB基因及其鄰近基因轉(zhuǎn)錄情況的研究目的：分析S. mutans中ptxA、ptxB基因及其鄰近的sgaT、SMU.273、SMU.274、SMU.2乃基因的轉(zhuǎn)錄情況,探究在S. mutans中是否存在與抗壞血酸轉(zhuǎn)運代謝相關(guān)的操縱子。方法：1.對JptxB基因及其鄰近基因進(jìn)行PCR分析。提取S. mutans的基因組DNA及總RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)S. mutans的全基因組序列,跨越SMU.268與sgaT (a), sgaT與ptxB(b), ptxB與txA (c), ptxA與SMU.273(d),SMU.273與SMU.274(e),SMU.274與SMU.275(D,SMU.2乃與SMU.277(g)設(shè)計引物,實驗組以cDNA為模版,陽性對照組以基因組DNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察實驗組是否出現(xiàn)與陽性對照組大小一致的條帶。2. qRT-PCR檢測抗壞血酸對S. mutans中ptxA、ptxB基因及其鄰近基因表達(dá)的影響。將野生型S. mutans分別置于抗壞血酸或葡萄糖特異性培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長后期,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以16S rRNA為內(nèi)參,使用qRT-PCR檢測抗壞血酸對ptxA、ptxB基因及其鄰近基因表達(dá)的影響。3.使用qRT-PCR檢測野生型S. mutans及ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的表達(dá)情況。4.統(tǒng)計學(xué)分析。采用SPSS 20.0軟件對qRT-PCR的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用兩獨立樣本t檢驗的方法,P0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果：1.瓊脂糖凝膠電泳顯示,b、c、d、e、f的實驗組在與陽性對照組一致的位置上出現(xiàn)了條帶,而a和g的實驗組未出現(xiàn)條帶。2.在抗壞血酸特異性培養(yǎng)基中,S. mutans UA159菌株的sgaT, ptxB, ptxA,SMU.273,SMU.274,SMU.2乃基因的mRNA表達(dá)量均顯著上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.與野生型S. mutans相比,ptxB基因缺陷菌株中ptxA基因的mRNA相對表達(dá)量值明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論：1. S. mutans的ptxA、ptxB基因與其上游的sgaT基因,及其下游的SMU.273,SMU.274,SMU.275基因?qū)儆谕粋�操縱子,且抗壞血酸可能為該操縱子的誘導(dǎo)劑。2. ptxA基因的表達(dá)可受其上游ptxB基因的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：變異鏈球菌 ptxA基因 ptxB基因 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) 抗壞血酸
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.1
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-22
• 第一章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因缺陷菌株及其功能補償菌株的構(gòu)建22-46
• 1 材料和方法22-37
• 2 結(jié)果37-43
• 3 討論43-46
• 第二章 變異鏈球菌ptxA、ptxB基因?qū)ζ渖飳W(xué)特性的影響46-57
• 1 材料和方法46-50
• 2 結(jié)果50-55
• 3 討論55-57
• 第三章 變異鏈球菌ptxA、ptxB及其鄰近基因轉(zhuǎn)錄情況的研究57-70
• 1 材料和方法57-66
• 2 結(jié)果66-68
• 3 討論68-70
• 全文總結(jié)70-71
• 參考文獻(xiàn)71-78
• 中英文對照縮略詞表78-79
• 成果79-81
• 致謝81-83

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陸史俊;魏昕;;變異鏈球菌耐酸分子機制的研究進(jìn)展[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

2 李小明;茍建重;;變異鏈球菌黏結(jié)素的提取及檢測[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2009年05期

3 李小明;茍建重;;全唾液中變異鏈球菌受體的檢測[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年02期

4 劉朝一,范生堯;營養(yǎng)變異鏈球菌的分離及鑒定[J];臨床檢驗雜志;1992年01期

5 崔巖,李世杰,朱姝媛,李玉軍;變異鏈球菌致亞急性感染性心內(nèi)膜炎一例[J];中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志;1999年05期

6 田曉蓓;何永紅;萬呼春;;變異鏈球菌蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

7 趙莉;林煥彩;;口腔變異鏈球菌表面蛋白與轉(zhuǎn)肽酶的關(guān)系[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

8 何永紅;田曉蓓;萬呼春;溫艷麗;張菲菲;馬琴睿;;變異鏈球菌蛋白質(zhì)提取方法研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年01期

9 霍麗s，

本文編號：837095