本文關鍵詞：CGF對雪旺細胞生物學行為及神經再生影響的研究

  更多相關文章： 神經再生 濃縮生長因子 雪旺細胞 增殖 分泌 遷移 整合素

【摘要】：周圍神經損傷是種植手術中一種嚴重的并發(fā)癥,神經損傷后患者會出現粘膜、頦部及下唇皮膚等不同程度的感覺功能障礙。雪旺細胞是周圍神經中主要的膠質細胞,在周圍神經損傷后的再生過程中發(fā)揮重要作用。如何促進雪旺細胞的增殖、遷移、分泌等一系列生物學行為,具有重要的研究意義。研究發(fā)現,某些生長因子如血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)具有促進雪旺細胞增殖、遷移等生物學行為的作用。但傳統生長因子的臨床應用面臨很多問題,如提取步驟復雜、提取純度不高、存在免疫排斥反應、體內穩(wěn)定性低、需要反復局部注射來保證作用濃度,且單一的生長因子注射在模擬復雜體內環(huán)境上存在局限性,因而需要尋求一種更理想的生長因子治療措施解決上述問題。濃縮生長因子(CGF)作為新一代的血小板濃縮物,內含多種生長因子如轉化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、FGF、IGF和VEGF等,是一種可靠的生長因子來源。它取自患者自體靜脈血,兼具采集方便、制作簡單、成本低廉、無免疫排斥反應等優(yōu)點。同時因為它內含大量血小板及生長因子,相比單一生長因子,可能提供一種更豐富的更能滿足細胞生長需求的生理環(huán)境,這為其治療周圍神經損傷提供了可能。本實驗利用體外實驗研究了CGF對雪旺細胞增殖、神經營養(yǎng)因子分泌功能及遷移能力的影響,并探究了CGF促進雪旺細胞遷移的機制;利用體內試驗研究了CGF對周圍神經損傷后功能恢復及再生神經組織結構的影響,以期為臨床應用CGF治療種植術中神經損傷提供一定的理論基礎。1.CGF的結構和生長因子釋放規(guī)律本實驗使用掃描電子顯微鏡觀察CGF的超微結構,通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測CGF內TGF-β1的釋放規(guī)律。掃描電鏡觀察顯示CGF具有纖細的纖維結構,纖維相互交錯,形成三維網狀結構,其中可見大量中央凹陷呈扁圓形的紅細胞和表面多突起的血小板。纖維平均直徑為0.36±0.14μm,孔隙率為40.44±2.97%。ELISA檢測顯示CGF中TGF-β1的釋放可以至少持續(xù)13天,在第1天時TGF-β1的釋放濃度為75 pg/ml,隨后逐漸增加,至第5天時達到高峰130 pg/ml,之后逐漸減少,至第13天時減少至60pg/ml。CGF的結構特點和生長因子持續(xù)釋放能力為其成為良好的細胞支架和生長因子供體提供了基礎。2.CGF對雪旺細胞增殖能力的影響本實驗通過CCK-8實驗及細胞周期分析檢測了CGF對雪旺細胞增殖能力的影響。CCK-8結果顯示,200%、100%、50%濃度的CGF條件培養(yǎng)液均可促進雪旺細胞增殖,其中100%的CGF條件培養(yǎng)液促進增殖效果最明顯。因而,選擇100%的CGF條件培養(yǎng)液作為最佳濃度進行后續(xù)實驗。細胞周期分析結果顯示,CGF條件培養(yǎng)液組的細胞增殖指數(PI)顯著高于DMEM對照組,進一步證明了CGF對雪旺細胞的增殖具有促進作用。3.CGF對雪旺細胞神經營養(yǎng)分泌功能的影響本實驗通過RT-q PCR和Western blot,分別從m RNA及蛋白水平檢測了CGF對雪旺細胞分泌NGF和GDNF的影響。RT-q PCR結果顯示,在第1、2、3天時,CGF組NGF及GDNF的m RNA表達水平均顯著高于DMEM組(p0.05):在各個檢測時間點,CGF組NGF m RNA表達量分別是DMEM組的1.3、1.6、1.8倍,CGF組GDNF m RNA表達量分別是DMEM組的1.8、1.6、1.6倍。Werstern blot結果顯示,CGF組NGF蛋白表達量在培養(yǎng)第2、3天顯著增高,分別是DMEM組的1.1倍和1.5倍;CGF組GDNF蛋白表達量在培養(yǎng)第3天顯著增高,是DMEM對照組的1.3倍。綜上,CGF可以促進雪旺細胞的神經營養(yǎng)因子分泌功能。4.CGF對雪旺細胞遷移能力的影響及其機制本實驗中采用細胞劃痕實驗觀察CGF對雪旺細胞的遷移能力有無影響。雪旺細胞的遷移受多種信號通路的調節(jié),其中整合素通路是重要調控通路之一,本實驗采用Western blot檢測整合素β1及其下游信號分子(p-FAK)的表達情況,以確定整合素β1信號通路是否參與了CGF介導的雪旺細胞遷移過程。利用RNA干擾技術,使整合素β1基因沉默,觀察在整合素β1基因缺失狀態(tài)下,CGF對雪旺細胞遷移作用的影響有無改變。劃痕實驗結果顯示,CGF培養(yǎng)組的細胞遷移率是DMEM培養(yǎng)組的4.25倍,表明CGF可以促進雪旺細胞的遷移。Western blot結果顯示CGF作用后雪旺細胞內整合素β1和p-FAK的表達水平升高,表明整合素β1信號通路參與了CGF誘導的雪旺細胞遷移過程。構建不同的si RNA質粒(si RNA-1、si RNA-2和si RNA-3)轉染雪旺細胞后,RT-q PCR和Western blot結果顯示,si RNA-2具有最佳的基因沉默效果:si RNA-2可使細胞整合素β1的m RNA表達水平降低70-80%,使其蛋白表達水平降低70%。整合素β1被si RNA-2沉默后,Transwell細胞遷移實驗顯示,CGF仍然可以促進雪旺細胞的遷移。綜上,CGF可以促進雪旺細胞遷移,整合素β1信號通路參與了該過程。但CGF誘導的細胞遷移并非完全通過該信號通路,可能還存在其他分子作用途徑。5.CGF促進周圍神經再生的體內研究本實驗建立了大鼠體內坐骨神經壓迫損傷模型,利用足跡分析來觀察CGF對神經損傷后功能恢復的影響,利甲苯胺藍染色和透射電鏡觀察CGF對損傷后神經組織結構的影響。足跡分析實驗顯示CGF治療后,其坐骨神經功能指數(SFI)顯著高于對照組,表明CGF可以促進損傷后神經的功能恢復。甲苯胺藍染色結果顯示,神經損傷后其髓鞘發(fā)生變形,新生有髓神經纖維較少,而使用CGF治療后,神經纖維髓鞘形狀規(guī)則,并可見到大量新生的有髓神經纖維。透射電鏡觀察顯示神經損傷后軸突與髓鞘內層分離,有髓神經纖維形狀不規(guī)則,板層扭曲,排列不均;使用CGF治療的有髓神經纖維排列比較整齊,板層無明顯的扭曲,周圍出現較多新生的有髓神經纖維,且雪旺細胞增殖明顯。綜上,CGF可以促進周圍神經損傷后功能的恢復及組織結構的改善。
【關鍵詞】：神經再生 濃縮生長因子 雪旺細胞 增殖 分泌 遷移 整合素
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R745;R783.6
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 前言16-18
• 第1章 緒論18-32
• 1.1 周圍神經再生的研究進展18-27
• 1.1.1 周圍神經的組織結構18-19
• 1.1.2 周圍神經損傷后的變性與再生19-21
• 1.1.3 雪旺細胞在周圍神經再生中的作用21-26
• 1.1.4 周圍神經損傷后的治療方案26-27
• 1.2 濃縮生長因子（CGF）的研究進展27-30
• 1.2.1 血小板濃縮物的發(fā)展歷程27-28
• 1.2.2 CGF的特點及應用28-30
• 1.3 實驗設計30-31
• 1.4 實驗創(chuàng)新性31-32
• 第2章 CGF的結構和生長因子釋放規(guī)律32-42
• 2.1 材料32-33
• 2.1.1 儀器和耗材32-33
• 2.1.2 主要試劑33
• 2.1.3 主要軟件33
• 2.1.4 實驗動物33
• 2.2 方法33-36
• 2.2.1 CGF的制備33-34
• 2.2.2 CGF的結構34-35
• 2.2.3 CGF中TGF-β1 釋放規(guī)律35-36
• 2.3 結果36-38
• 2.3.1 CGF的結構36-38
• 2.3.2 CGF中TGF-β1 釋放規(guī)律38
• 2.4 討論38-40
• 2.5 小結40-42
• 第3章 CGF對雪旺細胞增殖能力的影響42-52
• 3.1 材料43-44
• 3.1.1 儀器和耗材43
• 3.1.2 主要試劑43-44
• 3.1.3 主要軟件44
• 3.1.4 實驗動物及細胞44
• 3.2 方法44-47
• 3.2.1 CGF條件培養(yǎng)基的制備44
• 3.2.2 雪旺細胞的培養(yǎng)44-46
• 3.2.3 CCK-8 檢測細胞增殖情況46
• 3.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期46-47
• 3.3 結果47-49
• 3.3.1 雪旺細胞形態(tài)觀察47
• 3.3.2 CCK-8 檢測細胞增殖情況47-48
• 3.3.3 流式細胞儀檢測細胞周期48-49
• 3.4 討論49-51
• 3.5 小結51-52
• 第4章 CGF對雪旺細胞神經營養(yǎng)分泌功能的影響52-66
• 4.1 材料52-54
• 4.1.1 儀器和耗材52-53
• 4.1.2 主要試劑53-54
• 4.1.3 主要軟件54
• 4.1.4 實驗動物及細胞54
• 4.2 方法54-60
• 4.2.1 RT-q PCR檢測NGF及GDNF m RNA表達情況54-57
• 4.2.2 Western-blot檢測NGF及GDNF蛋白表達情況57-60
• 4.3 結果60-63
• 4.3.1 NGF及GDNF m RNA表達情況60-61
• 4.3.2 NGF及GDNF蛋白表達情況61-63
• 4.4 討論63-65
• 4.5 小結65-66
• 第5章 CGF對雪旺細胞遷移能力的影響及其機制66-84
• 5.1 材料67-69
• 5.1.1 儀器和耗材67
• 5.1.2 主要試劑67-68
• 5.1.3 主要應用軟件68
• 5.1.4 實驗動物及細胞68-69
• 5.2 方法69-75
• 5.2.1 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力69
• 5.2.2 Western blot檢測整合素 β1 及其下游信號分子的表達69-70
• 5.2.3 構建si RNA質粒70-73
• 5.2.4 整合素 β1 基因沉默73
• 5.2.5 RT-q PCR和Western blot驗證整合素 β1 沉默情況73-74
• 5.2.6 Transwell檢測整合素 β1 沉默后細胞遷移能力74-75
• 5.3 結果75-80
• 5.3.1 CGF對雪旺細胞遷移能力的影響75-76
• 5.3.2 Western blot檢測整合素 β1 及其下游信號分子的表達76-78
• 5.3.3 整合素 β1 基因沉默情況78-79
• 5.3.4 Transwell檢測整合素 β1 沉默后細胞遷移能力79-80
• 5.4 討論80-82
• 5.5 小結82-84
• 第6章 CGF促進周圍神經再生的體內研究84-92
• 6.1 材料84-85
• 6.1.1 儀器和耗材84
• 6.1.2 主要試劑84-85
• 6.1.3 實驗動物85
• 6.2 方法85-86
• 6.2.1 建立動物模型85
• 6.2.2 足跡分析85-86
• 6.2.3 神經組織結構觀察86
• 6.2.4 神經組織超微結構分析86
• 6.3 結果86-88
• 6.3.1 足跡分析86-87
• 6.3.2 神經組織結構觀察87-88
• 6.3.3 神經組織超微結構分析88
• 6.4 討論88-90
• 6.5 小結90-92
• 第七章 結論92-94
• 參考文獻94-110
• 作者簡介及在讀期間科研成果110-112
• 致謝112-113

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本文編號：775536