本文關(guān)鍵詞：CGF對雪旺細(xì)胞生物學(xué)行為及神經(jīng)再生影響的研究

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【摘要】：周圍神經(jīng)損傷是種植手術(shù)中一種嚴(yán)重的并發(fā)癥,神經(jīng)損傷后患者會(huì)出現(xiàn)粘膜、頦部及下唇皮膚等不同程度的感覺功能障礙。雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)中主要的膠質(zhì)細(xì)胞,在周圍神經(jīng)損傷后的再生過程中發(fā)揮重要作用。如何促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖、遷移、分泌等一系列生物學(xué)行為,具有重要的研究意義。研究發(fā)現(xiàn),某些生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)具有促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為的作用。但傳統(tǒng)生長因子的臨床應(yīng)用面臨很多問題,如提取步驟復(fù)雜、提取純度不高、存在免疫排斥反應(yīng)、體內(nèi)穩(wěn)定性低、需要反復(fù)局部注射來保證作用濃度,且單一的生長因子注射在模擬復(fù)雜體內(nèi)環(huán)境上存在局限性,因而需要尋求一種更理想的生長因子治療措施解決上述問題。濃縮生長因子(CGF)作為新一代的血小板濃縮物,內(nèi)含多種生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、FGF、IGF和VEGF等,是一種可靠的生長因子來源。它取自患者自體靜脈血,兼具采集方便、制作簡單、成本低廉、無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)因?yàn)樗鼉?nèi)含大量血小板及生長因子,相比單一生長因子,可能提供一種更豐富的更能滿足細(xì)胞生長需求的生理環(huán)境,這為其治療周圍神經(jīng)損傷提供了可能。本實(shí)驗(yàn)利用體外實(shí)驗(yàn)研究了CGF對雪旺細(xì)胞增殖、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌功能及遷移能力的影響,并探究了CGF促進(jìn)雪旺細(xì)胞遷移的機(jī)制;利用體內(nèi)試驗(yàn)研究了CGF對周圍神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)及再生神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的影響,以期為臨床應(yīng)用CGF治療種植術(shù)中神經(jīng)損傷提供一定的理論基礎(chǔ)。1.CGF的結(jié)構(gòu)和生長因子釋放規(guī)律本實(shí)驗(yàn)使用掃描電子顯微鏡觀察CGF的超微結(jié)構(gòu),通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測CGF內(nèi)TGF-β1的釋放規(guī)律。掃描電鏡觀察顯示CGF具有纖細(xì)的纖維結(jié)構(gòu),纖維相互交錯(cuò),形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其中可見大量中央凹陷呈扁圓形的紅細(xì)胞和表面多突起的血小板。纖維平均直徑為0.36±0.14μm,孔隙率為40.44±2.97%。ELISA檢測顯示CGF中TGF-β1的釋放可以至少持續(xù)13天,在第1天時(shí)TGF-β1的釋放濃度為75 pg/ml,隨后逐漸增加,至第5天時(shí)達(dá)到高峰130 pg/ml,之后逐漸減少,至第13天時(shí)減少至60pg/ml。CGF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生長因子持續(xù)釋放能力為其成為良好的細(xì)胞支架和生長因子供體提供了基礎(chǔ)。2.CGF對雪旺細(xì)胞增殖能力的影響本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期分析檢測了CGF對雪旺細(xì)胞增殖能力的影響。CCK-8結(jié)果顯示,200%、100%、50%濃度的CGF條件培養(yǎng)液均可促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖,其中100%的CGF條件培養(yǎng)液促進(jìn)增殖效果最明顯。因而,選擇100%的CGF條件培養(yǎng)液作為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示,CGF條件培養(yǎng)液組的細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)顯著高于DMEM對照組,進(jìn)一步證明了CGF對雪旺細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。3.CGF對雪旺細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)分泌功能的影響本實(shí)驗(yàn)通過RT-q PCR和Western blot,分別從m RNA及蛋白水平檢測了CGF對雪旺細(xì)胞分泌NGF和GDNF的影響。RT-q PCR結(jié)果顯示,在第1、2、3天時(shí),CGF組NGF及GDNF的m RNA表達(dá)水平均顯著高于DMEM組(p0.05):在各個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn),CGF組NGF m RNA表達(dá)量分別是DMEM組的1.3、1.6、1.8倍,CGF組GDNF m RNA表達(dá)量分別是DMEM組的1.8、1.6、1.6倍。Werstern blot結(jié)果顯示,CGF組NGF蛋白表達(dá)量在培養(yǎng)第2、3天顯著增高,分別是DMEM組的1.1倍和1.5倍;CGF組GDNF蛋白表達(dá)量在培養(yǎng)第3天顯著增高,是DMEM對照組的1.3倍。綜上,CGF可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌功能。4.CGF對雪旺細(xì)胞遷移能力的影響及其機(jī)制本實(shí)驗(yàn)中采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CGF對雪旺細(xì)胞的遷移能力有無影響。雪旺細(xì)胞的遷移受多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié),其中整合素通路是重要調(diào)控通路之一,本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測整合素β1及其下游信號(hào)分子(p-FAK)的表達(dá)情況,以確定整合素β1信號(hào)通路是否參與了CGF介導(dǎo)的雪旺細(xì)胞遷移過程。利用RNA干擾技術(shù),使整合素β1基因沉默,觀察在整合素β1基因缺失狀態(tài)下,CGF對雪旺細(xì)胞遷移作用的影響有無改變。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CGF培養(yǎng)組的細(xì)胞遷移率是DMEM培養(yǎng)組的4.25倍,表明CGF可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的遷移。Western blot結(jié)果顯示CGF作用后雪旺細(xì)胞內(nèi)整合素β1和p-FAK的表達(dá)水平升高,表明整合素β1信號(hào)通路參與了CGF誘導(dǎo)的雪旺細(xì)胞遷移過程。構(gòu)建不同的si RNA質(zhì)粒(si RNA-1、si RNA-2和si RNA-3)轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后,RT-q PCR和Western blot結(jié)果顯示,si RNA-2具有最佳的基因沉默效果:si RNA-2可使細(xì)胞整合素β1的m RNA表達(dá)水平降低70-80%,使其蛋白表達(dá)水平降低70%。整合素β1被si RNA-2沉默后,Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示,CGF仍然可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的遷移。綜上,CGF可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞遷移,整合素β1信號(hào)通路參與了該過程。但CGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移并非完全通過該信號(hào)通路,可能還存在其他分子作用途徑。5.CGF促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的體內(nèi)研究本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠體內(nèi)坐骨神經(jīng)壓迫損傷模型,利用足跡分析來觀察CGF對神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)的影響,利甲苯胺藍(lán)染色和透射電鏡觀察CGF對損傷后神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的影響。足跡分析實(shí)驗(yàn)顯示CGF治療后,其坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)顯著高于對照組,表明CGF可以促進(jìn)損傷后神經(jīng)的功能恢復(fù)。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示,神經(jīng)損傷后其髓鞘發(fā)生變形,新生有髓神經(jīng)纖維較少,而使用CGF治療后,神經(jīng)纖維髓鞘形狀規(guī)則,并可見到大量新生的有髓神經(jīng)纖維。透射電鏡觀察顯示神經(jīng)損傷后軸突與髓鞘內(nèi)層分離,有髓神經(jīng)纖維形狀不規(guī)則,板層扭曲,排列不均;使用CGF治療的有髓神經(jīng)纖維排列比較整齊,板層無明顯的扭曲,周圍出現(xiàn)較多新生的有髓神經(jīng)纖維,且雪旺細(xì)胞增殖明顯。綜上,CGF可以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后功能的恢復(fù)及組織結(jié)構(gòu)的改善。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)再生 濃縮生長因子 雪旺細(xì)胞 增殖 分泌 遷移 整合素
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R745;R783.6
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 前言16-18
• 第1章 緒論18-32
• 1.1 周圍神經(jīng)再生的研究進(jìn)展18-27
• 1.1.1 周圍神經(jīng)的組織結(jié)構(gòu)18-19
• 1.1.2 周圍神經(jīng)損傷后的變性與再生19-21
• 1.1.3 雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)再生中的作用21-26
• 1.1.4 周圍神經(jīng)損傷后的治療方案26-27
• 1.2 濃縮生長因子（CGF）的研究進(jìn)展27-30
• 1.2.1 血小板濃縮物的發(fā)展歷程27-28
• 1.2.2 CGF的特點(diǎn)及應(yīng)用28-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)30-31
• 1.4 實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性31-32
• 第2章 CGF的結(jié)構(gòu)和生長因子釋放規(guī)律32-42
• 2.1 材料32-33
• 2.1.1 儀器和耗材32-33
• 2.1.2 主要試劑33
• 2.1.3 主要軟件33
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 2.2 方法33-36
• 2.2.1 CGF的制備33-34
• 2.2.2 CGF的結(jié)構(gòu)34-35
• 2.2.3 CGF中TGF-β1 釋放規(guī)律35-36
• 2.3 結(jié)果36-38
• 2.3.1 CGF的結(jié)構(gòu)36-38
• 2.3.2 CGF中TGF-β1 釋放規(guī)律38
• 2.4 討論38-40
• 2.5 小結(jié)40-42
• 第3章 CGF對雪旺細(xì)胞增殖能力的影響42-52
• 3.1 材料43-44
• 3.1.1 儀器和耗材43
• 3.1.2 主要試劑43-44
• 3.1.3 主要軟件44
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞44
• 3.2 方法44-47
• 3.2.1 CGF條件培養(yǎng)基的制備44
• 3.2.2 雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)44-46
• 3.2.3 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖情況46
• 3.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期46-47
• 3.3 結(jié)果47-49
• 3.3.1 雪旺細(xì)胞形態(tài)觀察47
• 3.3.2 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖情況47-48
• 3.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期48-49
• 3.4 討論49-51
• 3.5 小結(jié)51-52
• 第4章 CGF對雪旺細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)分泌功能的影響52-66
• 4.1 材料52-54
• 4.1.1 儀器和耗材52-53
• 4.1.2 主要試劑53-54
• 4.1.3 主要軟件54
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞54
• 4.2 方法54-60
• 4.2.1 RT-q PCR檢測NGF及GDNF m RNA表達(dá)情況54-57
• 4.2.2 Western-blot檢測NGF及GDNF蛋白表達(dá)情況57-60
• 4.3 結(jié)果60-63
• 4.3.1 NGF及GDNF m RNA表達(dá)情況60-61
• 4.3.2 NGF及GDNF蛋白表達(dá)情況61-63
• 4.4 討論63-65
• 4.5 小結(jié)65-66
• 第5章 CGF對雪旺細(xì)胞遷移能力的影響及其機(jī)制66-84
• 5.1 材料67-69
• 5.1.1 儀器和耗材67
• 5.1.2 主要試劑67-68
• 5.1.3 主要應(yīng)用軟件68
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞68-69
• 5.2 方法69-75
• 5.2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力69
• 5.2.2 Western blot檢測整合素 β1 及其下游信號(hào)分子的表達(dá)69-70
• 5.2.3 構(gòu)建si RNA質(zhì)粒70-73
• 5.2.4 整合素 β1 基因沉默73
• 5.2.5 RT-q PCR和Western blot驗(yàn)證整合素 β1 沉默情況73-74
• 5.2.6 Transwell檢測整合素 β1 沉默后細(xì)胞遷移能力74-75
• 5.3 結(jié)果75-80
• 5.3.1 CGF對雪旺細(xì)胞遷移能力的影響75-76
• 5.3.2 Western blot檢測整合素 β1 及其下游信號(hào)分子的表達(dá)76-78
• 5.3.3 整合素 β1 基因沉默情況78-79
• 5.3.4 Transwell檢測整合素 β1 沉默后細(xì)胞遷移能力79-80
• 5.4 討論80-82
• 5.5 小結(jié)82-84
• 第6章 CGF促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的體內(nèi)研究84-92
• 6.1 材料84-85
• 6.1.1 儀器和耗材84
• 6.1.2 主要試劑84-85
• 6.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物85
• 6.2 方法85-86
• 6.2.1 建立動(dòng)物模型85
• 6.2.2 足跡分析85-86
• 6.2.3 神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)觀察86
• 6.2.4 神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)分析86
• 6.3 結(jié)果86-88
• 6.3.1 足跡分析86-87
• 6.3.2 神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)觀察87-88
• 6.3.3 神經(jīng)組織超微結(jié)構(gòu)分析88
• 6.4 討論88-90
• 6.5 小結(jié)90-92
• 第七章 結(jié)論92-94
• 參考文獻(xiàn)94-110
• 作者簡介及在讀期間科研成果110-112
• 致謝112-113

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2 黃明;應(yīng)用免疫磁珠法分離提純雪旺細(xì)胞及其增殖的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

3 韓峰;低濃度血清法培養(yǎng)純化新生大鼠雪旺細(xì)胞[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

4 高宏陽;去細(xì)胞同種異體神經(jīng)種植雪旺細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)觀察[D];河北醫(yī)科大學(xué);2006年

5 劉鈺;雪旺細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)及純化的實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2004年

6 田永祥;雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)及相關(guān)性狀的實(shí)驗(yàn)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2004年

7 秦潔;富血小板纖維蛋白對雪旺細(xì)胞的影響[D];吉林大學(xué);2012年

8 張心怡;大鼠耳蝸雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)、純化及增殖的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

9 郝偉;Adeno-X Tet-On System轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)乳鼠雪旺細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

10 夏雯涵;微囊化兔雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)及相關(guān)研究[D];南昌大學(xué);2006年

本文編號(hào)：775536