本文關(guān)鍵詞：牙齦卟啉單胞菌感染牙周膜成纖維細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 牙齦卟啉單胞菌 牙周膜成纖維細(xì)胞 細(xì)胞因子 破骨細(xì)胞

【摘要】：目的分離培養(yǎng)牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLF)利用紫外可見分光光度計(jì)測量細(xì)菌濃度,將牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)活菌制備成109、108.107、106、105CFU/ml懸液,體外感染PDLF 6小時(shí)后檢測細(xì)胞活性、炎性因子和骨代謝相關(guān)基因的表達(dá),研究不同濃度P.gingivalis對PDLF的細(xì)胞活性、炎性因子和骨代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法利用組織塊法分離培養(yǎng)PDLF,胰酶消化傳代培養(yǎng)至第3--4代備用。P.gingivalis活菌在4℃條件下4000 r/min離心5分鐘,棄去培養(yǎng)基,PBS緩沖液沖洗、4℃條件下4000 r/min離心5分鐘,重復(fù)2次后,PBS緩沖液重懸,利用紫外可見分光光度計(jì)測量活菌懸液的濃度,當(dāng)OD660=0.8時(shí),細(xì)菌濃度為109 CFU/ml。將此活菌懸液于4℃條件下4000 r/min離心5分鐘,棄去上清PBS緩沖液,加入等量不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸,制成109CFU/ml的P. gingivalis活菌DMEM培養(yǎng)基懸液。將此懸液用不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋分別成濃度為108、107、106、105CFU/ml的懸液。將P. gingivalis活菌分別以109、108、107、106、105CFU/ml濃感染PDLF 6小時(shí),于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)、RANKL和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)的基因表達(dá)。結(jié)果P. gingivalis活菌感染PDLF 6小時(shí)后,倒置相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形。當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到109 CFU/ml時(shí),肉眼觀察可見培養(yǎng)基渾濁,倒置相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,胞膜不完整,胞核不清晰。臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示與對照組相比,P. gingivalis活菌感染PDLF6小時(shí)后,細(xì)胞活率均下降,隨著細(xì)菌濃度的升高,細(xì)胞活率逐漸下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)P. gingivalis活菌濃度從105CFU/ml升高至109CFU/ml時(shí),促炎細(xì)胞因子IL-6.IL-1β、TNF-α和RANKL的mRNA相對表達(dá)量均升高。對照組相比,P. gingivalis濃度達(dá)到108CFU/ml時(shí),IL-6的mRNA相對表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),P.gingivalis活菌濃度達(dá)到109 CFU/ml時(shí),IL-1β、TNF-α的mRNA相對表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。P.gingivalis活菌感染PDLF6小時(shí)后趨化因子IL-8的mRNA相對表達(dá)量升高,當(dāng)P. gingivalis活菌濃度達(dá)到107 CFU/ml時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。此外,P. gingivalis活菌濃度從105 CFU/ml升高至109 CFU/ml, RANKL的mRNA相對表達(dá)量亦升高,于108 CFU/ml時(shí)相對表達(dá)量最高,但與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P. gingivalis活菌感染PDLF 6 h后所有實(shí)驗(yàn)組OPG的mRNA表達(dá)均明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),當(dāng)P. gingivalis活菌濃度為109 CFU/ml時(shí),OPG的mRNA相對表達(dá)量最低。結(jié)論P(yáng). gingivalis活菌感染PDLF6小時(shí)后,細(xì)胞活性無明顯改變,P. gingivalis活菌可刺激PDLF產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子,進(jìn)而參與牙周組織的破壞與改建。
【關(guān)鍵詞】：牙齦卟啉單胞菌 牙周膜成纖維細(xì)胞 細(xì)胞因子 破骨細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1. 引言11-18
• 1.1 P.gingivalis的生物學(xué)特性11
• 1.2 P.gingivalis的致病性11-15
• 1.3 P.gingivalis與口腔及全身疾病的關(guān)系15-17
• 1.4 牙周膜成纖特性17-18
• 2. 材料與方法18-21
• 2.1 主要材料和試劑18
• 2.2 PDLF的分離和培養(yǎng)18
• 2.3 P.gingivalis的培養(yǎng)與鑒定18-19
• 2.4 P.gingivalis活菌體外感染PDLF19
• 2.5 臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性19-20
• 2.6 實(shí)時(shí)定量PCR20-21
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理21
• 3. 結(jié)果21-25
• 3.1 P. gingivalis活菌感染PDLF 6小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察21-22
• 3.2 臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性22
• 3.3 實(shí)時(shí)定量qRT-PCR檢測P.gingivalis活菌感染PDLF 6小時(shí)后的mRNA表達(dá)22-25
• 4. 討論25-31
• 5. 結(jié)論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-38
• 附圖38-40
• 附錄 個(gè)人簡介40-42
• 致謝42-43
• 綜述43-52
• 參考文獻(xiàn)50-52

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本文編號：769503