本文關(guān)鍵詞：咬合垂直距離升高對(duì)不同年齡大鼠深層咬肌影響的研究

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【摘要】：目的：適合穩(wěn)定的咬合垂直距離(occlusal vertical dimension,OVD)對(duì)于充分發(fā)揮咀嚼肌的咀嚼效能,減少咀嚼肌的損傷以及維持面部平衡協(xié)調(diào)至關(guān)重要。同時(shí),正常的肌肉結(jié)構(gòu)與功能是維持正常咬合垂直距離的解剖基礎(chǔ)。在正畸臨床治療過程中,經(jīng)常遇到對(duì)深覆牙合病人進(jìn)行升高咬合垂直距離(increasing occlusal vertical dimension,i OVD)的情況。雖然對(duì)于大多數(shù)患者來說,治療是成功的,但臨床上也有一部分患者出現(xiàn)深覆牙合復(fù)發(fā)的情況。其中持肌肉學(xué)派觀點(diǎn)的學(xué)者認(rèn)為建立適當(dāng)?shù)墓δ苄约∑胶鈱?duì)于矯治的穩(wěn)定是非常重要的,保持期的長(zhǎng)短取決于組織結(jié)構(gòu)和功能的改建。因此,據(jù)此推測(cè),咬合升高后肌肉的結(jié)構(gòu)和功能未發(fā)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變可能是導(dǎo)致深覆牙合復(fù)發(fā)的重要原因之一。咬肌作為咀嚼肌群中最主要的升頜肌,其功能的發(fā)揮與咬合垂直距離密切相關(guān)。咬合垂直距離的增加又勢(shì)必造成咬肌纖維拉伸,機(jī)械負(fù)載增加。哺乳動(dòng)物的骨骼肌具有高度可塑性,在肌肉負(fù)載變化的情況下可以在生理允許范圍內(nèi)發(fā)生解剖、生理、組織化學(xué)及生物化學(xué)特性的改變,使其對(duì)能量的需求最優(yōu)化,最終使肌肉組織在組織結(jié)構(gòu)及生理功能上與機(jī)體的改變相適應(yīng)。咬合垂直距離增加后咬肌是否會(huì)發(fā)生與其它骨骼肌拉伸后相似的變化僅有少量報(bào)道;同時(shí),咬合升高對(duì)于成年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響尚未見報(bào)道。本研究擬通過建立咬合垂直距離升高的動(dòng)物模型,研究咬合垂直距離升高對(duì)不同年齡大鼠深層咬肌的影響,初步探討咬合垂直距離升高對(duì)咬肌影響的分子信號(hào)機(jī)制,為研究正畸臨床對(duì)不同年齡患者進(jìn)行咬合垂直距離升高后肌肉的變化和矯治遠(yuǎn)期的穩(wěn)定性提供相關(guān)的理論依據(jù)。方法:第一部分咬合垂直距離升高動(dòng)物模型的建立1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組48只雄性Wistar大鼠按照月齡分為兩組:青少年組(1.5月齡)及年輕成年組(8月齡),每組24只。兩組內(nèi)又分別設(shè)置對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)亞組,每組12只。即按照年齡及是否進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為青少年對(duì)照組(teenager control group,group TC),青少年實(shí)驗(yàn)組(teenager experimental group,group TE),年輕成年對(duì)照組(young adult control group,group YAC),年輕成年實(shí)驗(yàn)組(young adult experimental group,group TE)。實(shí)驗(yàn)組大鼠上頜佩戴咬合板升高咬合,對(duì)照組僅進(jìn)行操作對(duì)照。2咬合垂直距離升高的方法實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,麻醉劑量為0.3ml/100g體重。隔濕,使用35%磷酸酸蝕雙側(cè)上頜磨牙牙合面20秒。流水沖洗后涂布粘接劑,光照10秒。雙側(cè)第一磨牙合面堆塑樹脂以升高咬合,使上頜第一磨牙區(qū)咬合板高度為1.5mm,第三磨牙區(qū)咬合板高度為1mm,光照20秒,使用慢速打磨機(jī)去除咬合早接觸點(diǎn)。3操作對(duì)照的方法對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組采用同樣麻醉方法麻醉,僅作后牙牙合面酸蝕,但不放置咬合板,即僅進(jìn)行操作對(duì)照。4咬合升高動(dòng)物模型建立的評(píng)價(jià)4.1動(dòng)物的一般情況的觀察實(shí)驗(yàn)期間每天固定時(shí)間點(diǎn)分兩次記錄兩組動(dòng)物一般情況,包括:咬合板的存留情況、大鼠的行為學(xué)變化及體重變化。4.2牙牙合變化觀察每日定時(shí)對(duì)大鼠牙牙合變化進(jìn)行觀察,并于咬合升高前(T0)、咬合升高當(dāng)天(T1)、咬合升高7天(T7)及14天(T14)進(jìn)行數(shù)碼相片的拍攝。4.3頭顱側(cè)位片觀察于T0、T1、T7及T14四個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)拍攝各組大鼠頭顱側(cè)位片,通過FUJI PRIMA Console軟件對(duì)X光片進(jìn)行定點(diǎn)并對(duì)咬合垂直距離(VT間距)進(jìn)行測(cè)量,每一張X線片由不同觀察者重復(fù)測(cè)量?jī)纱�。通過比較同一年齡組內(nèi)咬合升高組與對(duì)照組間的咬合垂直距離的差異以及不同年齡組間咬合升高前后垂直距離的變化鑒定模型是否建立成功。4.4 HE染色觀察于實(shí)驗(yàn)觀察節(jié)點(diǎn)7天、14天分別處死不同年齡實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠各6只,立即于大鼠的深層咬肌中央進(jìn)行取材,組織塊大小為8mm×5mm×3mm,異戊烷液氮速凍, 80℃超低溫冰箱凍存。使用HE染色觀察咬合升高對(duì)咬肌影響。第二部分咬合垂直距離升高對(duì)不同年齡大鼠深層咬肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型建立同第一部分2標(biāo)本留取用于組織化學(xué)染色的咬肌標(biāo)本的采集及處理方法同第一部分。電鏡標(biāo)本留取組織塊大小為1mm×1mm×3mm,4%戊二醛固定2小時(shí)后送檢。3組織化學(xué)分析使用三磷酸腺苷酶染色(ATPase)及還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH-TR)染色后光鏡下觀察肌纖維形態(tài),使用Image-Pro Plus軟件計(jì)數(shù)咬肌各型肌纖維數(shù)目,并計(jì)算各型肌纖維百分比的變化。4透射電鏡觀察透射電鏡下觀察各組咬肌的肌絲、肌小節(jié)、線粒體、肌漿網(wǎng)等結(jié)構(gòu)的改變。第三部分咬合垂直距離升高對(duì)大鼠咬肌MHC亞型m RNA表達(dá)的影響及MHC亞型轉(zhuǎn)變的機(jī)制探討1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型建立同第一部分2標(biāo)本留取于實(shí)驗(yàn)觀察節(jié)點(diǎn)7天、14天分別處死不同年齡實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠各6只。于大鼠的深層咬肌中央進(jìn)行取材,預(yù)冷生理鹽水沖洗血液,液氮速凍, 80℃超低溫冰箱凍存。3將所取標(biāo)本應(yīng)用real-time PCR技術(shù)對(duì)咬肌MHC亞型m RNA與生肌調(diào)節(jié)因子Myo D、myogenin m RNA水平進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)。主要步驟包括組織勻漿、Trizol法提取總RNA、RNA完整性檢測(cè)、引物設(shè)計(jì)合成、反轉(zhuǎn)錄合成c DNA第一鏈、PCR擴(kuò)增、??CT法檢測(cè)咬合垂直距離升高對(duì)MHC亞型m RNA及生肌調(diào)節(jié)因子Myo D、myogenin m RNA水平的影響,并對(duì)重鏈肌球蛋白的m RNA及myogenin:Myo D m RNA水平做相關(guān)性分析。結(jié)果:第一部分咬合垂直距離升高動(dòng)物模型的建立1動(dòng)物的一般情況觀察1.1咬合板存留情況觀察不同年齡大鼠咬合板在實(shí)驗(yàn)期間均有良好的固位,無咬合板脫落的情況發(fā)生。1.2動(dòng)物的行為學(xué)觀察不同年齡組的大鼠在佩戴咬合板后初期的不適反應(yīng)經(jīng)過一周后逐漸改善,至觀察期末咬合升高組行為學(xué)反應(yīng)與對(duì)照組基本一致。1.3體重變化青少年實(shí)驗(yàn)組和年輕成年實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組相比體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05。說明咬合升高未明顯影響大鼠營(yíng)養(yǎng)的攝入和體重增長(zhǎng)。2牙牙合變化口外觀,后牙被動(dòng)咬合時(shí)青少年大鼠及年輕成年大鼠的上切牙均覆蓋下切牙唇面約2mm。在咬合升高后14天的觀察期內(nèi),青少年大鼠較年輕成年大鼠更快的恢復(fù)至咬合升高前前牙咬合狀態(tài)�？趦�(nèi)觀可見兩組不同年齡大鼠咬牙合板在實(shí)驗(yàn)期間均有良好的固位和口腔衛(wèi)生狀況。隨時(shí)間的增加,咬合板牙合面未見明顯不均勻磨耗現(xiàn)象。3頭顱側(cè)位片的觀察咬合垂直距離升高后,在觀察期內(nèi)不同年齡大鼠的實(shí)驗(yàn)組的咬合垂直距離均大于對(duì)照組的VT值,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組VT間距的差值在不同年齡組間及在同一年齡組內(nèi)隨時(shí)間變化無明顯差別(P0.05)。說明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的咬合升高成功,且兩組的咬合升高程度較一致,觀察期內(nèi)隨時(shí)間變化一致,模型可以用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。4 HE染色觀察青少年大鼠及年輕成年組大鼠對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組咬肌纖維的形態(tài)、排列、細(xì)胞核的形態(tài)以及組織間質(zhì)均未見異常,不同年齡組間無明顯差異。第二部分咬合垂直距離升高對(duì)不同年齡大鼠深層咬肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的1組織化學(xué)分析結(jié)果ATPase染色證明深層咬肌的肌纖維型僅包括MHCⅡ型纖維NADH-TR染色將MHCⅡ型纖維進(jìn)一步分為三種亞型:深藍(lán)紫色的MHCⅡa型,淺藍(lán)紫色的MHCⅡb型及介于二者之間的MHCⅡx型纖維。青少年大鼠的深層咬肌主要由MHCⅡb型纖維構(gòu)成,其次為MHCⅡa及MHCⅡx。隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng),青少年對(duì)照組大鼠的深層咬肌的MHCⅡa減少而MHCⅡb增多,且變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)對(duì)青少年大鼠給予咬合升高刺激時(shí),咬合升高7天時(shí),對(duì)照組MHCⅡa纖維的比例為25.24±2.70%,而實(shí)驗(yàn)組的MHCⅡa的比例為45.50±1.89%,即實(shí)驗(yàn)組較同期對(duì)照組MHCⅡa所增高;而MHCⅡb及MHCⅡx的比例有所下降。當(dāng)咬合升高14天時(shí),MHCⅡa的纖維比例又有一定的下降,MHCⅡb的纖維比例隨之上升。青少年對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠的MHCⅡa的纖維比例均大于年輕成年組MHCⅡa的纖維比例。年輕成年組大鼠的深層咬肌也主要由MHCⅡb型纖維構(gòu)成,其次為MHCⅡx及MHCⅡa。隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組MHCⅡ各型纖維之間的比例變化不明顯。當(dāng)對(duì)年輕成年組大鼠給予咬合升高刺激時(shí),咬合升高7天時(shí),對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的MHCⅡa及MHCⅡb纖維比例的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,當(dāng)咬合升高14天時(shí),MHCⅡa的纖維才開始上升,MHCⅡb的纖維比例隨之下降。2透射電鏡觀察結(jié)果咬合垂直距離升高對(duì)咬肌肌絲排列及線粒體結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生影響。青少年大鼠較年輕成年組大鼠在咬合升高后肌絲改建速度以及線粒體代償性數(shù)目增多、體積增大的現(xiàn)象出現(xiàn)的更早,而其他細(xì)胞器也較少出現(xiàn)的損傷性反應(yīng)。第三部分咬合垂直距離升高對(duì)大鼠咬肌MHC亞型m RNA表達(dá)的影響及MHC亞型轉(zhuǎn)變的機(jī)制探討1咬合垂直距離升高對(duì)不同年齡大鼠咬肌MHC亞型m RNA表達(dá)的影響1.1年齡對(duì)重鏈肌球蛋白m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響青少年對(duì)照組的MHCⅡa m RNA表達(dá)量高于年輕成年對(duì)照組,而MHCⅡb m RNA表達(dá)量低于年輕對(duì)照組,MHCⅡx m RNA在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1.2咬合垂直距離升高對(duì)重鏈肌球蛋白m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響咬合升高使青少年大鼠及年輕成年組大鼠的MHCⅡa m RNA相對(duì)表達(dá)量增加,MHCⅡb m RNA及MHCⅡx m RNA相對(duì)表達(dá)量降低;而年輕成年實(shí)驗(yàn)組大鼠MHCⅡa m RNA及MHCⅡb m RNA變化的時(shí)間較晚。青少年實(shí)驗(yàn)組較年輕成年實(shí)驗(yàn)組有更高的MHCⅡa m RNA水平,且MHCⅡb m RNA相對(duì)表達(dá)量較低。1.3時(shí)間變化對(duì)重鏈肌球蛋白m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響青少年對(duì)照組大鼠的MHCⅡa m RNA相對(duì)表達(dá)量隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸減小的趨勢(shì),MHCⅡb m RNA及MHCⅡx m RNA含量逐漸增加。而年輕成年對(duì)照組大鼠的MHCⅡa m RNA、MHCⅡb m RNA及MHCⅡx m RNA相對(duì)表達(dá)量隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化。青少年實(shí)驗(yàn)組大鼠的MHCⅡa m RNA相對(duì)含量隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)有逐漸減小的趨勢(shì),MHCⅡb m RNA含量有增加趨勢(shì);年輕成年實(shí)驗(yàn)組大鼠的MHCⅡa m RNA相對(duì)含量隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)增加,MHCⅡb m RNA含量隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng)降低,晚于青少年實(shí)驗(yàn)組大鼠向慢收縮MHC異構(gòu)型m RNA轉(zhuǎn)化的時(shí)間。2咬合垂直距離升高對(duì)不同年齡大鼠咬肌Myo D、myogenin m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響2.1年齡對(duì)Myo D、myogenin m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi),青少年大鼠對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的Myo D、myogenin m RNA相對(duì)表達(dá)量均高于年輕成年大鼠的Myo D、myogenin m RNA相對(duì)表達(dá)量(P0.05)。2.2咬合垂直距離升高對(duì)Myo D、myogenin m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響當(dāng)對(duì)青少年實(shí)驗(yàn)組大鼠及年輕成年實(shí)驗(yàn)組大鼠分別進(jìn)行咬合升高時(shí),兩組Myo D、myogenin m RNA的表達(dá)量都有所增加。2.3時(shí)間對(duì)Myo D、myogenin m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響除年輕成年組大鼠對(duì)照組的myogenin m RNA在14天觀察期內(nèi)無明顯變化外,青少年大鼠實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組以及年輕成年組大鼠實(shí)驗(yàn)組的Myo D、myogenin m RNA相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間增加相對(duì)含量降低(P0.05)。3咬合垂直距離升高對(duì)不同年齡大鼠myogenin:Myo D m RNA比值的影響3.1年齡對(duì)myogenin:Myo D m RNA比值的影響實(shí)驗(yàn)觀察期間青少年對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的myogenin:Myo D m RNA比值均高于年輕成年對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。3.2咬合垂直距離升高對(duì)myogenin:Myo D m RNA比值的影響咬合垂直距離升高使不同年齡組大鼠咬肌的myogenin:Myo D m RNA比值上升,年輕成年組上述比值升高晚于青少年組。3.3時(shí)間對(duì)myogenin:Myo D m RNA比值的影響隨觀察時(shí)間的延長(zhǎng),青少年對(duì)照組myogenin:Myo D m RNA比值有所下降,而年輕成年實(shí)驗(yàn)組的myogenin:Myo D m RNA比值有所增高。4 myogenin:Myo D m RNA比值與重鏈肌球蛋白各亞型m RNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析咬合垂直距離升高可使青少年及年輕成年大鼠深層咬肌的Myo D及myogenin m RNA水平都有所增加,而myogenin m RNA較Myo D m RNA升高的更多。myogenin:Myo D m RNA這一比值與MHCⅡa m RNA存在正相關(guān)關(guān)系,r=0.954;與MHCⅡb m RNA之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,r=-0.755。結(jié)論：1通過雙側(cè)磨牙牙合面直接堆塑樹脂建立咬合垂直距離升高動(dòng)物模型具有良好的可操作性及穩(wěn)定性。2咬合垂直距離升高可使青少年大鼠及年輕成年大鼠的深層咬肌的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、重鏈肌球蛋白m RNA均向較慢收縮類型發(fā)生適應(yīng)性轉(zhuǎn)化。3咬合垂直距離升高使青少年大鼠的深層咬肌發(fā)生肌纖維由快收縮型向慢收縮型轉(zhuǎn)化的時(shí)間較年輕成年大鼠更早、程度更高,提示在正畸臨床中于青少年時(shí)期進(jìn)行深覆牙合的矯治其咬合垂直距離更穩(wěn)定。同時(shí)也說明對(duì)年輕成年患者進(jìn)行咬合升高治療需足夠的時(shí)間并在治療后需要進(jìn)行長(zhǎng)期的保持。4生肌調(diào)節(jié)因子Myo D和myogenin在纖維類型轉(zhuǎn)變中發(fā)揮著一定的作用。
【關(guān)鍵詞】：咬合垂直距離升高 深層咬肌 重鏈肌球蛋白 MyoD myogenin
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R782
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本文編號(hào)：761069