本文關(guān)鍵詞：HSP90α蛋白抑制劑17-AAG聯(lián)合熱療誘導(dǎo)口腔舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的研究

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【摘要】：[目的]探索HSP90 α蛋白抑制劑17-AAG聯(lián)合熱療誘導(dǎo)口腔舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的作用及相關(guān)分子機制。[方法](1)細胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,置37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Tca8113細胞。(2)實驗分組：(a)常規(guī)培養(yǎng)Tca8113細胞,43℃80min熱誘導(dǎo)處理后分別培養(yǎng)3h、6h、12h、24h、48h; (b)①對照組(常規(guī)培養(yǎng)Tca8113細胞)；②熱誘導(dǎo)組(43℃ 80min熱誘導(dǎo)處理Tca8113細胞)③17-AAG組(10μg/ml 17-AAG處理Tca8113細胞)④17-AAG+熱誘導(dǎo)組(10μg/ml17-AAG+43℃ 80min熱誘導(dǎo)處理Tca8113細胞)。(3)蛋白免疫印跡法檢測熱誘導(dǎo)Tca8113細胞后HSP90α蛋白表達的動態(tài)變化。(4)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。(5)CCK8法檢測細胞增殖抑制率。(6)Annexin V-FITC/PI熒光標(biāo)記,流式細胞儀檢測Tca8113細胞凋亡率。(7)JC-1染色,流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位。(8)酶標(biāo)儀檢測各組細胞Caspase-3相對活性。(9)免疫印跡檢測Bcl-2和Bax蛋白相對表達量的變化及PKC-8蛋白的斷裂活化情況。(10)SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。[結(jié)果](1)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),對照組Tca8113細胞中HSP90a相對表達量為(0.14±0.01)；加熱后3h組為(0.15±0.02),較對照組未有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；加熱后6h組為(0.20-0.01),較對照組未有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；加熱后12h組為(0.72-0.06),較對照組表達升高(P0.05)；加熱后24h組為(0.89±0.14),較對照組表達明顯升高(P0.01)；加熱后48h組為(0.46±0.05),較對照組表達升高(P0.05)。(2)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：熱誘導(dǎo)組Tca8113細胞變圓、皺縮,浮起狀。17-AAG組,細胞貼壁不均勻,部分細胞脫落。藥熱聯(lián)合組,大量細胞皺縮、變圓,形態(tài)不規(guī)則,部分細胞碎裂漂浮于培養(yǎng)基中。(3)CCK8檢測細胞增殖抑制率發(fā)現(xiàn)：熱誘導(dǎo)組Tca8113細胞增殖抑制率為(12.93±3.07)%,17-AAG組細胞增殖抑制率為(16.85±2.79)%,藥熱聯(lián)合組細胞增殖抑制率為(35.05±8.23)%。17-AAG組與熱誘導(dǎo)組比較,差異無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。藥熱聯(lián)合組與17-AAG組或熱誘導(dǎo)組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(4)流式細胞儀檢測細胞凋亡率,對照組Tca8113細胞凋亡率為(3.19±0.89)%,熱誘導(dǎo)組處理Tca8113細胞24小時后凋亡率為(10.57±0.80)%,與對照組相比,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)； 17-AAG處理Tca8113細胞24小時后凋亡率為(20.99±1.65)%,與對照組相比,統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異(P0.05)；藥熱聯(lián)合處理細胞24小時后凋亡率為(40.67±2.04)%,明顯高于熱誘導(dǎo)組或17-AAG組(P0.05)。(5)線粒體膜電位檢測結(jié)果：對照組Tca8113細胞線粒體膜JC-1單體含量為(5.67±1.20)%；熱誘導(dǎo)組為(20.49±2.12)%,17-AAG組為(31.89±1.31)%,藥熱聯(lián)合組為(55.09±3.43)%,熱誘導(dǎo)組或17-AAG組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),藥熱聯(lián)合組明顯高于熱誘導(dǎo)組或17-AAG組(p0.05)。(6)活化Caspase-3檢測結(jié)果：對照組Tca8113細胞活化Caspase-3比值為(1.04±0.09)%,熱誘導(dǎo)組比值為(3.21±0.17)%,與對照組相比,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)： 17-AAG組比值為(5.16±0.23)%,與對照組相比,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；藥熱聯(lián)合組比值為(8.45±0.58)%,明顯高于熱誘導(dǎo)組和17-AAG組(P0.05)。(7)免疫印跡檢測結(jié)果：①對照組Tca8113細胞Bcl-2相對表達量為(1.06±0.07)；熱誘導(dǎo)組為(0.60±0.02),較對照組表達降低(P0.05)；17-AAG組為(0.74±0.03),較對照組表達降低(P0.05)；藥熱聯(lián)合組為(0.43±0.04),較對照組表達明顯降低(P0.05)。②對照組細胞Bax相對表達量為(0.62+0.03)；熱誘導(dǎo)組為(0.94±0.13),較對照組表達升高(P0.05)；17-AAG組為(1.21±0.11),較對照組和熱誘導(dǎo)組表達升高(P0.05)；藥熱聯(lián)合組為(1.72±0.21),較其余各組表達明顯升高(P0.05)。③17-AAG組細胞PKC-8相對表達量為(0.42±0.20),與對照組(0.77±0.11)比較,PKC-8表達降低(P0.05)；藥熱聯(lián)合組(0.42±0.18)與對照組比較,PKC-8表達明顯降低(P0.05)。④17-AAG組細胞PKC-δ的斷裂活化片段PKC-8 CF相對表達量為(0.50±0.04),與對照組(0.32±0.10)或熱誘導(dǎo)組(0.32±0.07)比較,PKC-8 CF表達升高(P0.05)；藥熱聯(lián)合組為(0.74±0.05),與各組比較,PKC-8 CF表達明顯升高(P0.05)。[結(jié)論]Hsp90α蛋白抑制劑17-AAG聯(lián)合熱療能夠誘導(dǎo)口腔舌鱗癌Tca8113細胞凋亡的發(fā)生,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達,促進PKC-δ蛋白的斷裂活化。
【關(guān)鍵詞】：HSP90α蛋白 17-AAG Tca8113細胞 熱療 細胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 英文縮略表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-22
• 一、主要試劑、設(shè)備及材料14-16
• 1. 主要試劑14-15
• 2. 主要設(shè)備15-16
• 3. 細胞株16
• 4. 試劑配制16
• 二、實驗方法16-22
• 1. 細胞培養(yǎng)16
• 2. 熱誘導(dǎo)處理16
• 3. 實驗分組16-17
• 4. 細胞形態(tài)觀察17
• 5. 細胞增殖抑制率檢測17
• 6. 細胞凋亡率檢測17-18
• 7. 線粒體膜電位檢測18
• 8. Caspase-3活性檢測18-19
• 9. 免疫印跡(Western Blot)19-21
• 10. 統(tǒng)計學(xué)分析21-22
• 結(jié)果22-37
• 一、HSP90α免疫印跡檢測結(jié)果22-23
• 二、細胞形態(tài)觀察結(jié)果23-24
• 三、細胞增殖抑制率結(jié)果24-25
• 四、流式細胞儀檢測細胞的凋亡率結(jié)果25-27
• 五、線粒體膜電位檢測結(jié)果27-29
• 六、Caspase-3活性檢測結(jié)果29-31
• 七、Bcl-2、Bax、PKC-δ疫印跡檢測結(jié)果31-37
• 討論37-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-47
• 綜述47-55
• 參考文獻53-55
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況55-56
• 致謝56

【共引文獻】

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本文編號：760740