本文關(guān)鍵詞：炎癥微環(huán)境下組蛋白去乙�；瘜�(duì)牙周膜干細(xì)胞再生能力的影響

  更多相關(guān)文章： 組蛋白去乙�；� 牙周膜干細(xì)胞 炎癥微環(huán)境 成骨分化 NaB TSA

【摘要】：牙周疾病是口腔最常見(jiàn)的疾病之一,嚴(yán)重危害牙周健康和口腔健康,其中牙周炎是一類由牙菌斑生物膜引起的牙周組織的慢性感染性疾病,可引起牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)等牙周支持組織的破壞,導(dǎo)致炎癥發(fā)生及牙周袋形成、進(jìn)行性附著喪失、和牙槽骨吸收,嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)䦟?dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落,此外,牙周炎與全身健康也有著密切的關(guān)系。目前,尚沒(méi)有有效的手段對(duì)牙周病進(jìn)行根治。牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一類存在于牙周組織的間充質(zhì)干細(xì)胞,已被證實(shí)為牙周組織再生重要的種子細(xì)胞。眾所周知,基質(zhì)微環(huán)境的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和細(xì)胞外信號(hào)共同調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新和多向分化潛能,而炎癥不僅改變了干細(xì)胞基質(zhì)微環(huán)境的平衡,還能影響其內(nèi)源性信號(hào)的調(diào)控作用。研究表明,炎癥微環(huán)境下PDLSCs的再生能力減弱,因此,如何改善或恢復(fù)因微環(huán)境改變而引起的PDLSCs下降的成骨能力成為牙周再生的一個(gè)新思路。前期研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳機(jī)制與微環(huán)境的改變有密切的關(guān)系,而組蛋白去乙酰化作為表觀修飾中一種重要的調(diào)控機(jī)制,在牙周病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。組蛋白去乙�；瘎�(dòng)態(tài)平衡由組蛋白去乙�；�(Histone deacetylases,HDACs)和組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyl transferases,HATs)共同維持,而組蛋白去乙�；敢种苿�(Histone deacetylase inhibitors,HDACIs/HDIs)被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟,抑制破骨細(xì)胞生成和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,對(duì)骨再生具有正向調(diào)控作用。因此本實(shí)驗(yàn)首先分別從健康牙周膜組織和牙周炎癥牙周膜組織中分離純化出PDLSCs,比較HDACs在兩種不同來(lái)源的干細(xì)胞中的表達(dá)差異;其次利用HDACIs(NaB和TSA)抑制HDACs功能后,探究其在炎癥微環(huán)境下對(duì)PDLSCs成骨分化和骨形成能力的影響;最后建立大鼠牙周炎模型,檢測(cè)NaB和TSA對(duì)牙周炎引起的牙槽骨缺失的影響,為探究基于干細(xì)胞的牙周組織再生治療提供一種新思路,也為臨床牙周炎的治療探索新的潛在治療藥物。第一部分健康組織和炎癥組織來(lái)源的PDLSCs的分離培養(yǎng)與鑒定及生物學(xué)特性的研究目的體外分離培養(yǎng)H-PDLSCs和P-PDLSCs,并對(duì)兩種細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定和比較。方法(1)有限稀釋法單克隆分離培養(yǎng)獲取正常和慢性炎癥組織來(lái)源的PDLSCs(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的表面分子標(biāo)志物的表達(dá)(3)MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測(cè)并比較(4)成骨、成脂分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較兩種干細(xì)胞的多向分化能力結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)中成功獲取了H-PDLSCs和P-PDLSCs,鏡下觀察均有間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài),有限稀釋法培養(yǎng)有細(xì)胞克隆形成,具有自我更新能力。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面分子標(biāo)記物STRO-1、CD105、CD90和CD146均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),造血干細(xì)胞分子標(biāo)記物CD34和CD45陰性表達(dá)。(3)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)炎癥組織來(lái)源的PDLSCs增殖能力高于正常組織來(lái)源的PDLSCs;克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,炎癥組PDLSCs克隆形成率明顯高于正常組。(4)成骨、成脂分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在一定條件下,兩種不同來(lái)源的PDLSCs均有骨向分化和脂向分化能力,但炎癥組的PDLSCs成骨分化能力較正常組有明顯的下降,而兩者的成脂分化能力差異并不顯著。結(jié)論(1)H-PDLSCs和P-PDLSCs為間充質(zhì)干細(xì)胞,具有自我更新能力和多向分化潛能。(2)炎癥微環(huán)境影響了干細(xì)胞的生物學(xué)特性,牙周炎癥組織來(lái)源的PDLSCs成骨分化能力減弱。第二部分NaB和TSA對(duì)P-PDLSCs骨向分化能力的影響目的檢測(cè)炎癥微環(huán)境下PDLSCs中HDACs的表達(dá)變化,篩選合適濃度的HDACIs(NaB和TSA)進(jìn)行加藥處理,檢測(cè)NaB和TSA抑制HDACs功能后對(duì)H-PDLSCs和P-PDLSCs成骨分化能力的影響,并初步探討其所作用的組蛋白乙�；稽c(diǎn)。方法(1)利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)正常微環(huán)境和炎癥微環(huán)境下PDLSCs中HDAC1-11的表達(dá)差異,篩選一種特異性變化的HDAC-X,然后通過(guò)Western blot檢測(cè)驗(yàn)證,以此篩選出特異性的HDAC-X,并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)分別設(shè)置NaB和TSA不同的藥物濃度梯度,通過(guò)Western blot檢測(cè)選擇本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的合適濃度。(3)MTT法檢測(cè)兩種HDACIs對(duì)PDLSCs增殖能力的影響,并于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。(4)對(duì)各組進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo),通過(guò)ALP染色和茜素紅染色比較各組ALP活性和基質(zhì)礦化能力的變化,利用Western blot檢測(cè)各組成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。(5)免疫組織化學(xué)分別檢測(cè)NaB和TSA在P-PDLSCs細(xì)胞膜片中的應(yīng)用。(6)分別用NaB和TSA處理P-PDLSCs 24h后Western blot檢測(cè)HDAC9及下游組蛋白乙�；揎椢稽c(diǎn)的變化。結(jié)果(1)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,炎癥微環(huán)境下HDACs的表達(dá)普遍升高,以HDAC9的升高最為顯著,Western blot檢測(cè)證明P-PDLSCs中HDAC9的蛋白表達(dá)增多。(2)利用不同濃度的NaB和TSA處理細(xì)胞后,通過(guò)Western blot檢測(cè)選擇本次實(shí)驗(yàn)的藥物濃度:NaB100μM和TSA100n M。(3)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,NaB和TSA對(duì)PDLSCs增殖能力無(wú)影響;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,細(xì)胞形態(tài)無(wú)異常,鏡下無(wú)死細(xì)胞形成。(4)通過(guò)ALP染色、茜素紅染色和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),NaB和TSA能促進(jìn)H-PDLSCs和P-PDLSCs的基質(zhì)礦化能力和成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。(5)免疫組化結(jié)果顯示,NaB和TSA明顯增強(qiáng)P-PDLSCs細(xì)胞外基質(zhì)成骨相關(guān)指標(biāo)Runx2的分泌。(6)分別用NaB和TSA作用于PDLSCs后可見(jiàn)HDAC9表達(dá)均下降,NaB處理后乙�；M蛋白H3K9、H3K18、H4K16的表達(dá)升高,以H4K16的升高最明顯;TSA處理后,可見(jiàn)H3K18表達(dá)升高。結(jié)論(1)炎癥微環(huán)境下PDLSCs中HDACs的表達(dá)普遍升高,組蛋白去乙�；癄顟B(tài)失衡。(2)在適宜的安全濃度下,NaB和TSA均能增強(qiáng)H-PDLSCs和P-PDLSCs的成骨分化能力。(3)NaB和TSA作為廣譜的HDACIs,可作用于H4K16、H3K18等乙�；稽c(diǎn)。第三部分NaB和TSA在P-PDLSCs裸鼠體內(nèi)異位移植和SD大鼠原位牙周再生中的研究目的探討NaB和TSA在體內(nèi)異位成骨和原位成骨中的作用。方法(1)制備各組PDLSCs細(xì)胞膜片,裸鼠皮下移植8周后取材,經(jīng)HE染色觀察各組新生骨生成情況。(2)利用LPS構(gòu)建SD大鼠牙周炎模型,分別局部注射NaB和TSA,Micro-CT觀察各組牙槽骨缺損的情況。結(jié)果(1)經(jīng)體內(nèi)裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NaB和TSA均可顯著促進(jìn)P-PDLSCs的新骨生成能力。(2)Micro-CT結(jié)果顯示,NaB和TSA明顯抑制SD大鼠牙周炎引起的牙槽骨缺失。結(jié)論NaB和TSA能顯著改善P-PDLSCs的成骨分化和骨再生能力,并能明顯抑制牙周炎引起的牙槽骨吸收。
【關(guān)鍵詞】：組蛋白去乙�；� 牙周膜干細(xì)胞 炎癥微環(huán)境 成骨分化 NaB TSA
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-20
• 文獻(xiàn)回顧20-29
• 第一部分 健康組織和炎癥組織來(lái)源的PDLSCs的分離培養(yǎng)與鑒定及生物學(xué)特性的研究29-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-39
• 4 討論39-41
• 第二部分 NaB和TSA對(duì)P-PDLSCs骨向分化能力的影響41-65
• 實(shí)驗(yàn)一 HDAC的篩選及NaB和TSA藥物濃度的選擇42-54
• 1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 2 實(shí)驗(yàn)方法43-48
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-52
• 4 討論52-54
• 實(shí)驗(yàn)二 NaB和TSA對(duì)P-PDLSCs成骨分化能力的影響54-62
• 1 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 2 實(shí)驗(yàn)方法55-57
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-60
• 4 討論60-62
• 實(shí)驗(yàn)三 NaB和TSA影響P-PDLSCs組蛋白乙�；饔冒悬c(diǎn)的初步探討62-65
• 1 實(shí)驗(yàn)材料62
• 2 實(shí)驗(yàn)方法62-63
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63
• 4 討論63-65
• 第三部分 NaB和TSA在P-PDLSCs裸鼠體內(nèi)異位移植和SD大鼠原位牙周再生中的研究65-73
• 實(shí)驗(yàn)一 NaB和TSA在P-PDLSCs體內(nèi)異位移植實(shí)驗(yàn)中的研究66-69
• 1 實(shí)驗(yàn)材料66
• 2 實(shí)驗(yàn)方法66-67
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-68
• 4 討論68-69
• 實(shí)驗(yàn)二 NaB和TSA在SD大鼠原位牙周再生中的研究69-73
• 1 實(shí)驗(yàn)材料69
• 2 實(shí)驗(yàn)方法69-70
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果70-71
• 4 討論71-73
• 小結(jié)73-75
• 參考文獻(xiàn)75-85
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果85-86
• 致謝86

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本文編號(hào)：744377