本文關鍵詞：納米結(jié)構脂質(zhì)載體載辛伐他汀體內(nèi)外成骨性能及成骨機制的研究

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【摘要】：近年來,口腔種植修復技術已成為治療牙列缺損及無牙合患者的主要修復方式。然而,多種因素導致的牙槽骨吸收大大限制了口腔種植修復技術的應用,如：齲病、牙周炎等長期缺牙后造成的牙槽嵴較嚴重的垂直向或水平向骨吸收,喪失量可達到原有骨寬度的50%;外傷或顱頜面部腫瘤導致牙齒缺失的同時伴有牙槽嵴部分或大范圍的缺損；患有先天性畸形或先天性基因缺陷的患者與生俱來伴有牙齒和牙槽骨的發(fā)育不全；以及近年來因人口老齡化現(xiàn)象而日益增多的骨質(zhì)疏松癥導致骨密度下降和骨吸收加快。而種植區(qū)牙槽骨的體積和骨的質(zhì)量又是影響種植修復成功的關鍵因素。因此,如何解決種植術區(qū)骨量不足或大范圍骨缺損,促進骨組織再生,恢復患者頜骨形態(tài)及功能,是近年來研究的一大熱點。全球每年與骨組織再生相關的手術多達130余萬,治療方案從自體骨移植、同種異體骨移植、異種骨組織移植、新型骨替代材料移植、引導骨再生到骨組織工程技術等都有大量的研究和報道。盡管這些方法已經(jīng)取得了巨大的進展,但仍存在各種各樣的問題,如：技術復雜、費用高、周期長、生物安全性不足等,骨組織工程技術還存在支架材料強度差、種子細胞來源受限、外源性生長因子價格昂貴等。因此,尋找一種簡單、廉價、安全且能誘導內(nèi)源性骨組織生長因子的方法來促進骨組織再生是目前口腔種植領域關注的一個熱點。有學者發(fā)現(xiàn)辛伐他汀小分子藥物可以誘導自身骨髓間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞并促進內(nèi)源性BMP-2成骨因子表達的作用,因此,把辛伐他汀應用于骨組織再生領域引起新的關注。辛伐他汀(simvastatin, SV)是一種無活性的小分子內(nèi)酯類藥物,它是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑,臨床上常用的一類降高血脂、降膽固醇類藥物,進入人體后經(jīng)由肝臟細胞內(nèi)活性酶轉(zhuǎn)化成可抑制甲羥戊酸合成功能的活性體。自1999年Mundy等首次從3000多種臨床藥物中篩選出他汀類藥物(SV和洛伐他汀)可促進體內(nèi)外成骨細胞中BMP-2基因的表達,越來越多的焦點集中在SV成骨性能的研究,并證明SV有較好的促成骨作用,包括可以促使BMSCs向骨缺損部位的遷移,促進成骨細胞的分化以及促進血管生成,同時還可以抑制破骨細胞的作用。但口服SV后,只有小于5%的藥物進入體循環(huán),大部分被肝臟代謝,到達骨組織部位且可被利用的藥物濃度更低,遠遠達不到促進新骨形成所需的劑量,而大劑量應用時可能會引起橫紋肌溶解等并發(fā)癥。因此,如何優(yōu)化SV的可利用度,提高其局部的藥物濃度,是目前亟待解決的問題之一。藥物緩釋系統(tǒng)是將納米新型技術與臨床藥物優(yōu)化結(jié)合的一種體現(xiàn)形式。良好的藥物緩釋系統(tǒng)可以在起到治療作用的同時降低藥物可能的毒副作用,實現(xiàn)藥物緩釋和靶向性,并避免藥物的過早擴散和清除。納米技術已被廣泛應用于提高難溶性藥物(如紫杉醇等抗腫瘤性藥物)生物利用度領域中,采用的制劑形式多樣并取得了顯著成果,如聚合物納米粒、納米混懸劑、脂質(zhì)體、微乳、脂質(zhì)納米粒、膠束等。其中以天然或合成的類脂為原料的脂質(zhì)類納米載體可以有效增加難溶性藥物的溶解度,尤其適用于生物藥劑學分類系統(tǒng)(BCS)中Ⅱ類(低溶解度,高滲透性)和Ⅳ類藥物(低溶解度,低滲透性)的遞送；可以有效增加藥物的跨膜轉(zhuǎn)運能力；進入體內(nèi)可被巨噬細胞作為外界異物吞噬,具有較強的被動靶向性并選擇性的集中于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),特異性地靶向肝脾組織；同時納米載體可以延長藥物在血液中滯留時間,起到一定的緩釋藥物儲庫作用;且類脂材料無毒、無免疫原性、易被機體吸收,同時避免使用毒性較大的表面活性劑和有機溶劑；給藥途徑多樣化,易于多功能表面修飾,且有良好的市場前景等。第二代脂質(zhì)納米粒-納米結(jié)構脂質(zhì)載體(nanostructured liquid carriers, NLC)是采用液態(tài)脂質(zhì)(如油酸、蓖麻油、中鏈脂肪酸甘油酯等)和固體脂質(zhì)混合作為脂質(zhì)材料而制成的納米粒,由于液體脂質(zhì)的參與,可以顯著提高藥物的載藥量,并打亂了固體脂質(zhì)原本的有序結(jié)構,使脂質(zhì)結(jié)構更加穩(wěn)定,不易發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變而結(jié)晶,從而提高了藥物的載藥率和穩(wěn)定性。有學者研究發(fā)現(xiàn)納米結(jié)構脂質(zhì)載體載辛伐他汀(nanostructured lipid carriers containing simvastatins, SNs)相比單純的SV混懸液有延遲藥物緩慢釋放的作用。也有研究表明SNs較單純的SV生物利用度提高了2.55倍,在大鼠腸道的吸收明顯高于游離SV。但前研究者所采用的制備納米脂質(zhì)體的溶劑注射法和超聲乳化法均會引入部分有機溶劑,并殘留于最終產(chǎn)品中,且目前尚未見納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV用于骨再生方面的報道。因此,我們假設采用微射流法可以很好的實現(xiàn)NLC對SV的包裹,且相比同等含量的單純SV藥物有較好的體外釋放能力,同時,納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV較單純SV藥物有更好的促成骨作用。本實驗擬采用較新的微射流技術(Microfluidization)制備SNs,避免有機溶劑的使用且操作簡單；擬用MG-63成骨細胞為模型,來驗證SNs的促成骨性能,并探討相關促成骨機制；并擬通過建立兔顱骨標準骨缺損,來進一步驗證SNs的促成骨性能和相關成骨機制。以期尋找更好的藥物緩釋系統(tǒng),提高SV的生物利用度,促進SV的成骨效應,為臨床骨組織再生提供更好的解決方法和理論基礎。研究目的：1.研究納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV的生物學特性,嘗試尋找提高SV生物利用度的理想劑型；2.研究納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV較單純的SV藥物是否具有更優(yōu)的體內(nèi)外促成骨能力及其可能機制。研究內(nèi)容：第一部分：納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV的合成、檢測及優(yōu)選1.空白NLC的制備和優(yōu)選首先,利用微射流機根據(jù)組成成分比例的不同制備不同組別的NLCs,即：液態(tài)脂質(zhì)(OA)占總脂質(zhì)質(zhì)量的10%、25%和40%,表面活性劑P188占總體積的0、0.2%和0.4%及微射流次數(shù)1、2和4次,分17組制備空白NLCs,檢測粒徑、PI、Zeta電位；并用響應面分析法(box beken design,BBD)優(yōu)選最佳NLC的制備條件,其中X變量：OA濃度(X1, wt%,0.10 to 0.40)、P188濃度(X2, w/v%,0 to 0.40)、微射流的循環(huán)次數(shù)(X3,次數(shù),1-4次)；Y變量：粒徑(Y1),PI (Y2) and zeta點位(Y3)。2.根據(jù)BBD優(yōu)選的最佳NLCs制備條件,按照三種不同的理論載藥量(5%、10%和20%)進行載藥,并進行粒度分析、形貌觀察、載藥量和包封率測量及體外緩釋檢測。其中,馬爾文激光粒度儀檢測粒徑大小、多分散指數(shù)和zeta電位；透射電子顯微鏡檢測形貌；高效液相色譜儀檢測藥物包封率和載藥率；體外緩釋實驗采用透析法。第二部分：納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV體外成骨性能及成骨機制的研究1.MG-63細胞的培養(yǎng)取凍存MG-63細胞株復蘇,以1×106/ml密度接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的25 nl培養(yǎng)瓶中,置于37-℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。24小時后更換新鮮培養(yǎng)液,除去未貼壁細胞,以后每48-72小時換液,逐日觀察、記錄其生長、增殖情況。2.納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV對成骨細胞增殖和分化功能的影響實驗組分為：SNs組(2.5×10-9to 2.5×10-6M)、單純SV組(2.5×10-9to2.5×10-6M)、空白NLC組和空白對照組。分別檢測SNs對MG-63細胞的增殖(MTS法),堿性磷酸酶ALP活性,體外礦化能力(茜素紅染色法)以及骨鈣素的蛋白和mRNA表達的影響。第三部分：納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV體內(nèi)成骨性能及成骨機制的研究1.動物模型的建立和標本制取二十只健康新西蘭大白兔,雄性,5-6個月齡,由廣東省實驗動物檢測所供。嚴格按照無菌操作流程進行,麻醉后常規(guī)消毒鋪巾,顱頂垂直切口,翻粘骨膜全厚瓣,骨動力系統(tǒng)制備4個直徑為8mm的環(huán)形顱骨標準骨缺損,下方至硬腦膜。隨機分為四組：SNs(含0.5mg SV)混合骨粉組、0.5 mg單純SV混合骨粉組、骨粉組和空白對照組。分別將SNs(含0.5mg SV)混合骨粉、0.5 mg單純SV混合骨粉和骨粉植入環(huán)形顱骨標準骨缺損內(nèi),分層縫合。術后使用3d抗生素。術后4周處死,處死前13-14 d注射四環(huán)素,3-4 d注射鈣黃綠素。骨動力系統(tǒng)切取完整的顱骨并修整邊緣,備用。2.組織學分析對骨缺損修復區(qū)及鄰近骨組織行組織學、組織形態(tài)學及免疫組織化學分析。一半樣品行脫鈣處理,制作石蠟切片,行HE染色、ALP染色、Masson染色和OC免疫組織化學染色。顯微鏡下拍攝組織學照片后,利用IPP軟件對新生骨面積百分比進行測量。光學顯微鏡下觀察ALP染色陽性細胞及OC染色陽性細胞并計數(shù)。另一半樣品制作硬組織切片,共聚焦顯微鏡下觀察骨缺損內(nèi)雙熒光標記的骨組織再生情況,并用圖像測量軟件進行測量；通過甲苯氨藍染色法進一步觀察不同組別間的新骨再生情況。統(tǒng)計分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果用x±s表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ONE WAY ANOVA)或析因設計資料的方差分析,對資料行正態(tài)性檢驗分析及Levene's test檢驗方法行方差齊性檢驗,若方差齊且檢驗結(jié)果存在統(tǒng)計學差異者,則組間進一步行兩兩比較(Bonferroni檢驗方法);若方差不齊,則采用近似F檢驗Welch法,檢驗結(jié)果存在統(tǒng)計學差異時,進一步行多重比較(Dunnett's T3法)。若資料不符合正態(tài)分布,數(shù)據(jù)分析采用非參數(shù)的Kruskal-Wallis H檢驗,若檢驗結(jié)果存在統(tǒng)計學差異,則組間進一步行Mann-Whitney U檢驗。檢驗標準a=0.05。研究結(jié)果：1.本研究中,采用微射流法成功制備了SNs,采用三因素、三水平星點設計分析并優(yōu)化出最佳制備條件為OA濃度為40%(wt%),P188表面活性劑濃度為0.4%(w/v%),微射流機循環(huán)次數(shù)為4次。依據(jù)響應面分析的最佳制備條件,我們采用微射流法成功制備出了三種理論載藥量條件下的SNs (SV/NLC, wt%),平均粒徑為174.7nm,包封率高達94.1%,實際載藥率可達18.2。體外緩釋實驗結(jié)果表明SNs釋放SV較單純的SV有明顯的控釋效果。2.為了驗證SNs具有良好的生物學作用,本課題進行了體外細胞攝取實驗和增殖分化檢測實驗。通過細胞攝取實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米載藥進入成骨細胞是通過內(nèi)吞作用完成,細胞內(nèi)的熒光顆粒在37℃條件下會隨著濃度和時間的增加而增加。細胞增殖實驗結(jié)果表明,SNs相比單純的SV更能夠有效的促進細胞的增殖,且存在時間和劑量依賴性,在低濃度條件下會促進細胞增殖,而高濃度條件下存在輕微抑制現(xiàn)象,且高濃度的抑制作用可以通過納米載藥的緩控釋作用來減小。另外,細胞分化實驗結(jié)果表明,SNs能更好的促進堿性磷酸酶活性的表達、礦化結(jié)節(jié)的形成及相關成骨蛋白和成骨基因的表達。其中以含2.5×10-7 M和2.5×10-8M SV的SNs組效果最佳。3.為了研究SNs的體內(nèi)穩(wěn)定性、宿主反應性及早期的體內(nèi)促成骨能力,本研究制備了兔顱骨標準骨缺損模型。組織學、免疫組織化學和組織形態(tài)學檢測結(jié)果證明含0.5 mg SV的SNs組能更好的促進新骨形成、有更多的骨膠原和成骨細胞表達。組織形態(tài)學分析顯示,對照組的新生骨面積比為4.13±0.17%,當加入了0.5 mg SV藥物時,新生骨面積比增加到10.38±0.52%,當加入了含有0.5 mg SV的納米粒子時,新生骨面積比增加到16.26±0.59%,在沒有炎癥的情況下4周時在骨缺損處產(chǎn)生了大量的新骨。此外,組織學和熒光顯微鏡分析結(jié)果表明,4周時各個組都有不同程度的不規(guī)則新骨形成,大部分位于骨缺損的邊緣,少量位于骨缺損的中心。Masson三色染色結(jié)果表明,局部應用SNs可顯著增加骨缺損區(qū)早期骨膠原的再生和新生血管的形成。本研究還發(fā)現(xiàn),SNs可促進OC蛋白的表達,且免疫組織化學分析顯示新生骨的量與OC陽性細胞的數(shù)目成正比,在SNs組中比SV組中OC陽性細胞顯著增加,且四周時差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。結(jié)論：1.微射流法可成功制備出高包封率和載藥率的載SV的納米結(jié)構脂質(zhì)載體,同時具有較好的理化性能和良好的緩釋效果；2.納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV相比單純的SV更能夠有效的促進細胞的增殖和分化；該研究結(jié)果證實了納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV可通過類似于SV促進成骨細胞增值和分化的作用機制來促進成骨作用,但有關納米載藥促進成骨作用的具體機制需要更進一步的研究。3.含0.5 mg SV的納米結(jié)構脂質(zhì)載體載SV組能更好地促進兔顱骨標準骨缺損狀態(tài)下的新骨形成。
【關鍵詞】：納米結(jié)構脂質(zhì)載體 辛伐他汀 骨再生 標準骨缺損
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R783.6
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第一章 緒論22-37
• 1.1 口腔種植領域骨組織再生的研究22-27
• 1.2 辛伐他汀成骨作用的研究27-30
• 1.3 納米結(jié)構脂質(zhì)載體的概述30-35
• 1.4 相關課題思路35-36
• 1.5 課題的研究目的和內(nèi)容36-37
• 第二章 微射流均質(zhì)法制備納米結(jié)構脂質(zhì)載體載辛伐他汀37-52
• 2.1 儀器與材料37
• 2.2 實驗方法37-41
• 2.3 實驗結(jié)果41-47
• 2.4 討論47-50
• 2.5 小結(jié)50-52
• 第三章 納米結(jié)構脂質(zhì)載體載辛伐他汀體外成骨性能及成骨機制的研究52-83
• 3.1 儀器和材料52-55
• 3.2 實驗方法55-67
• 3.3 實驗結(jié)果67-80
• 3.4 討論80-81
• 3.5 結(jié)論81-83
• 第四章 納米脂質(zhì)載體載辛伐他汀體內(nèi)成骨性能及成骨機制的研究83-115
• 4.1 實驗試劑材料、儀器、手術器械83-88
• 4.2 實驗方法88-102
• 4.3 實驗結(jié)果102-111
• 4.4 討論111-114
• 4.5 結(jié)論114-115
• 參考文獻115-129
• 全文總結(jié)129-131
• 中英文縮略詞表131-132
• 論文成果132-133
• 致謝133-135

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本文編號：741304