本文關(guān)鍵詞：鈦納米管對(duì)鼠前成骨細(xì)胞生物學(xué)行為影響及作用機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 二氧化鈦納米管 黏著斑激酶 細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白 YAP

【摘要】：鈦由于具備優(yōu)良的機(jī)械和生物學(xué)性能已廣泛應(yīng)用于制作骨科與牙種植體,但由于其表面骨整合形成率較低,易引起種植體周?chē)?其遠(yuǎn)期愈后及穩(wěn)定性較差。如何能夠改善鈦種植體的組織相容性,使其具備一定的促成骨功能以加速骨整合目前已經(jīng)成為骨組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。對(duì)種植體材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)可為機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生積極應(yīng)答提供有利環(huán)境。二氧化鈦納米管陣列由于形態(tài)有序、管徑可控、具備較高表面親水性以及利于蛋白吸附等特征受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。但針對(duì)不同管徑大小對(duì)細(xì)胞成骨向分化等多種生物學(xué)行為的影響目前尚無(wú)定論。此外,細(xì)胞感受來(lái)源于材料表面結(jié)構(gòu)的機(jī)械刺激并產(chǎn)生生物應(yīng)答這一過(guò)程取決于細(xì)胞的粘附狀態(tài),后者涉及到黏著斑激酶及細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白相關(guān)機(jī)械信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的激活,但關(guān)于該機(jī)制如何對(duì)細(xì)胞形態(tài)、增殖及分化進(jìn)行調(diào)控,其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及亞細(xì)胞水平變化等問(wèn)題的研究尚不清晰。目的:1.觀察不同管徑二氧化鈦納米管表面細(xì)胞的生物學(xué)行為變化;2.探討鈦納米管對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響及其內(nèi)在機(jī)制;3.探尋黏著斑激酶家族在納米管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)促細(xì)胞成骨過(guò)程中的作用;4.考察FAK、Rho A和YAP之間的相互關(guān)系及三者在細(xì)胞粘附及分化過(guò)程中所發(fā)揮的作用。方法:以陽(yáng)極氧化法制備在鈦片及鈦種植體表面制備二氧化鈦納米管。1.掃描電鏡與原子力顯微鏡觀察其表面形貌及粗糙程度;分別在光滑面純鈦和不同管徑納米管材料表面培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡觀察黏著斑及細(xì)胞骨架形成情況;以5-溴脫氧尿嘧啶核苷法(Brd U)測(cè)定細(xì)胞增殖能力,Real-time PCR檢測(cè)其成骨相關(guān)基因表達(dá)水平,能譜分析細(xì)胞基質(zhì)成分,Micro-CT掃描和組織切片染色考察表面修飾納米管的種植體在體內(nèi)促成骨效應(yīng)。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同材料表面細(xì)胞周期變化,免疫印跡(Western blot)考察胞內(nèi)黏著斑激酶(FAK)、細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白(Rho A)表達(dá)水平,Brd U測(cè)定黏著斑激酶活性抑制劑、細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白抑制劑C3及其效應(yīng)因子(Rock)抑制劑Y27632對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響,非線性回歸分析評(píng)估各調(diào)控蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞增殖的相關(guān)關(guān)系。3.Western blot考察不同材料表面細(xì)胞PYK2及p-PYK2蛋白表達(dá)水平,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因過(guò)表達(dá)模型,si RNA干擾建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因敲減模型,Real-time PCR檢測(cè)不同細(xì)胞模型的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平。4.Image J軟件計(jì)算分析相同單位面積內(nèi)的細(xì)胞可粘附區(qū)域差異;激光共聚焦顯微鏡觀察YAP亞細(xì)胞分布;免疫共沉淀法考察細(xì)胞黏著斑內(nèi)FAK募集水平差異;免疫pull-down檢測(cè)Rho A活性變化;免疫印跡法和熒光素酶測(cè)定法考察細(xì)胞核內(nèi)、外YAP表達(dá)差異;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立YAP基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型;Real-time PCR檢測(cè)Rho A活性增強(qiáng)、抑制,以及YAP過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果:不同電壓制備出的二氧化鈦納米管管徑分別為40nm(STNTs)和150nm(LTNTs)。1.與光滑面純鈦(Flat Ti)相比,STNTs和LTNTs表面細(xì)胞伸展面積均減小(P0.05),形態(tài)長(zhǎng)寬比均增大(P0.05),其中LTNTs變化最為顯著(P0.05);培養(yǎng)1天時(shí)LTNTs組細(xì)胞增殖水平明顯高于其他組(P0.05),7天時(shí)STNTs和LTNTs組均下降(P0.05)。與Flat Ti相比,LTNTs和STNTs表面細(xì)胞分別在培養(yǎng)4天和21天時(shí)出現(xiàn)成骨相關(guān)基因表達(dá)水平升高(P0.05),其中LTNTs組升高最為顯著(P0.05);能譜分析結(jié)果顯示LTNTs和STNTs組細(xì)胞基質(zhì)中均出現(xiàn)鈣元素;Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)植入14天時(shí),大孔徑納米管修飾的種植體組周?chē)求w積分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)量均明顯高于光滑面種植體組(P0.05)。2.LTNTs組細(xì)胞培養(yǎng)1天時(shí)處于S期的細(xì)胞所占比例高于另外兩組(P0.05);LTNTs和STNTs組細(xì)胞中FAK、p-FAK和Rho A表達(dá)水平均明顯低于Flat Ti組(P0.05),且下降程度以LTNTs組最為顯著(P0.05),但該組細(xì)胞的Rho A/FAK相對(duì)蛋白水平較另外兩組顯著升高(P0.05);LTNTs組細(xì)胞在加藥黏著斑激酶抑制劑PF573228培養(yǎng)1天時(shí)增殖能力仍然最高(P0.05),Rho A活性抑制劑C3以及C3+PF573228同時(shí)加藥后比例均顯著下降(P0.05),Rock抑制劑Y27632加藥后增殖能力顯著低于Flat Ti組(P0.05);與MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料表面增殖能力相關(guān)性最大的指標(biāo)為Rho A/FAK相對(duì)蛋白表達(dá)水平(P=0.0017)。3.LTNTs組PYK2和p-PYK2表達(dá)較Flat Ti組和STNTs組顯著下降(P0.05);質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FAK、PYK2及FAK+PYK2過(guò)表達(dá)基因后,細(xì)胞內(nèi)FAK與PYK2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高(P0.05);si RNA對(duì)FAK、PYK2及FAK+PYK2進(jìn)行基因敲減后,細(xì)胞內(nèi)FAK與PYK2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯減低(P0.05);LTNTs表面PYK2過(guò)表達(dá)細(xì)胞的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P0.05)。4.三種材料表面的細(xì)胞可粘附區(qū)域的面積、黏著斑內(nèi)FAK募集水平、GTP-Rho A表達(dá)水平及YAP胞核內(nèi)表達(dá)量隨納米管管徑增加而遞減(P0.05);Flat Ti表面細(xì)胞充分伸展時(shí),黏著斑及細(xì)胞骨架纖維數(shù)目多、分布廣,STNTs上細(xì)胞伸展面積縮小時(shí)黏著斑與細(xì)胞骨架纖維數(shù)目減少,僅在細(xì)胞周邊局部區(qū)域可見(jiàn);LTNTs表面細(xì)胞周邊黏著斑與骨架纖維進(jìn)一步減少,僅分布于絲狀偽足凸起處;PF573228加藥后胞內(nèi)活性Rho A(GTP-Rho A)表達(dá)量下降(P0.05);C3加藥后成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯升高(P0.05);細(xì)胞在LTNTs表面過(guò)表達(dá)YAP或加入Rho A活性增強(qiáng)劑CN01后,胞核內(nèi)YAP分布增加,成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯降低(P0.05)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功制備出兩種孔徑的納米管;1.與Flat Ti相比,STNTs表面細(xì)胞面積減小,形態(tài)伸長(zhǎng),呈現(xiàn)一定的成骨向分化能力;LTNTs表面細(xì)胞伸展面積進(jìn)一步縮減,形態(tài)趨于梭形,細(xì)胞生長(zhǎng)水平隨時(shí)間遞減,但在培養(yǎng)早期具備較高的增殖能力,體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其具備較高的促成骨效應(yīng)。2.LTNTs對(duì)細(xì)胞早期增殖有促進(jìn)作用,當(dāng)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抑制細(xì)胞內(nèi)FAK表達(dá)水平時(shí),細(xì)胞骨架蛋白調(diào)控因子Rho A相關(guān)信號(hào)通路對(duì)其增殖能力的維持或促進(jìn)發(fā)揮重要影響作用。3.LTNTs表面細(xì)胞內(nèi)FAK及PYK2蛋白表達(dá)同時(shí)受到抑制,但PYK2的低水平表達(dá)對(duì)細(xì)胞成骨向分化有正向調(diào)控作用。4.LTNTs拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供的可粘附面積較Flat Ti和STNTs表面顯著減小,MC3T3-E1細(xì)胞在其表面粘附面積受限,黏著斑內(nèi)FAK募集水平下降,黏著斑與細(xì)胞骨架形成障礙,Rho A活性減低,YAP亞細(xì)胞分布集中在細(xì)胞漿,細(xì)胞成骨向分化能力高,從亞細(xì)胞水平驗(yàn)證YAP作為FAK/Rho A機(jī)械傳導(dǎo)通路的下游信號(hào)因子對(duì)大孔徑納米管表面細(xì)胞形態(tài)改變及成骨向分化行為有重要調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同納米管管徑對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,針對(duì)納米管表面細(xì)胞形態(tài)、增殖及分化的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其相互之間的關(guān)系進(jìn)行研究,為篩選納米管管徑進(jìn)而提高其促成骨效應(yīng)提供依據(jù),為后期細(xì)胞生物應(yīng)答相關(guān)機(jī)制的研究奠定材料基礎(chǔ)。除提出FAK/Rho A機(jī)械傳導(dǎo)通路在納米管改變細(xì)胞增殖水平過(guò)程中的作用以外,本研究發(fā)現(xiàn)PYK2對(duì)納米管誘導(dǎo)鼠前體成骨細(xì)胞分化有重要調(diào)控作用,同時(shí)從亞細(xì)胞水平(YAP活性變化)為材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：二氧化鈦納米管 黏著斑激酶 細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白 YAP
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R783.1
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-18
• 前言18-24
• 第一部分 不同管徑鈦納米管對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的實(shí)驗(yàn)研究24-48
• 1 材料與方法24-33
• 2 結(jié)果33-44
• 3 討論44-48
• 第二部分 鈦納米管介導(dǎo)細(xì)胞增殖過(guò)程中FAK/RhoA信號(hào)通路的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究48-66
• 1 材料與方法48-52
• 2 結(jié)果52-62
• 3 討論62-66
• 第三部分 鈦納米管介導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化過(guò)程中PYK2信號(hào)通路的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究66-82
• 1 材料與方法66-68
• 2 結(jié)果68-79
• 3 討論79-82
• 第四部分 FAK/RhoA/YAP信號(hào)通路對(duì)鈦納米管表面MC3T3-E1細(xì)胞粘附、分化的調(diào)控機(jī)制相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究82-110
• 1 材料與方法82-88
• 2 結(jié)果88-104
• 3 討論104-110
• 參考文獻(xiàn)110-119
• 全文總結(jié)119-121
• 文獻(xiàn)綜述121-129
• 參考文獻(xiàn)125-129
• 致謝129-131
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文131

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