本文關(guān)鍵詞：人牙本質(zhì)基質(zhì)材料復(fù)合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于牙根再生的研究

  更多相關(guān)文章： 人牙本質(zhì)基質(zhì)材料 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 牙組織工程學(xué) 生物牙根

【摘要】：研究背景各種原因造成的牙齒缺失是人類的常見(jiàn)疾病,對(duì)患者的咀嚼、發(fā)音、美觀甚至心理健康都等有顯著影響。而目前,針對(duì)牙齒缺失的修復(fù)方法有很多,但最接近真牙,經(jīng)久耐用的方法卻較少。種植牙作為修復(fù)牙齒缺失一種良好的方法,可以與牙槽骨較好的結(jié)合(骨結(jié)合),但種植牙缺乏一種重要的天然牙根結(jié)構(gòu),即牙周組織[1]。因此,牙齒再生已成為國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。然而,要再生一個(gè)完整的牙,需要突破很多科學(xué)難點(diǎn),解決很多再生醫(yī)學(xué)共同的難題[2-4]。近幾年有學(xué)者提出生物牙根的概念,即利用組織工程方法,用自然界存在的或人工合成的、且具有一定空間結(jié)構(gòu)的、有良好生物相容性的材料為載體,將一些具有成牙能力的細(xì)胞以特定方式“種植”到這種載體支架上,然后提供這些細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和分化所需要的的生長(zhǎng)因子微環(huán)境。通過(guò)細(xì)胞相互間的黏附、生長(zhǎng)、增殖和分化,在體外或體內(nèi)形成具有一定牙周韌帶結(jié)構(gòu)的牙根[3]。單純的牙根構(gòu)建不涉及調(diào)控牙冠的形態(tài)和大小,在牙齒組織工程研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),如果能再生出一個(gè)具有牙周韌帶結(jié)構(gòu)的生物牙根,并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行樁冠修復(fù),將有望成為一種理想的修復(fù)牙缺失的再生醫(yī)學(xué)治療方法[3-5]。這種具有生物活性的且有一定天然牙根結(jié)構(gòu)的組織工程牙根有很大可能取代目前臨床上使用的種植義齒修復(fù)術(shù)。牙根再生是全牙再生的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,牙根再生的實(shí)現(xiàn)對(duì)于臨床應(yīng)用具有重要的意義,可為牙冠構(gòu)建或全牙構(gòu)建提供新的研究策略。種子細(xì)胞、支架材料和誘導(dǎo)微環(huán)境是生物牙根構(gòu)建的核心部分[6]。目前,已有學(xué)者利用組織工程技術(shù),使用牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞和生物支架材料在體內(nèi)或者體外成功的構(gòu)建了具有牙周膜、牙骨質(zhì)和牙槽骨的生物牙根[7]。然而,在此構(gòu)建中應(yīng)用的種子細(xì)胞均為牙源性干細(xì)胞[8-9]。雖然牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的成牙分化能力,但實(shí)際臨床上該類細(xì)胞僅能通過(guò)拔除正常牙齒才能獲得,且獲得的數(shù)量有限,因此在臨床上獲取患者自體牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞受到一定限制[4]。例如,對(duì)于無(wú)牙頜病人及全口牙缺失或者不愿拔出牙齒的患者,如何獲取到這些牙源性細(xì)胞,是一個(gè)有可能阻礙今后牙根再生在臨床上應(yīng)用的問(wèn)題。在牙源性干細(xì)胞來(lái)源受到限制的情況下,探索利用人體中已成功分離出的具有轉(zhuǎn)分化能力的多種成體干細(xì)胞進(jìn)行牙齒再生成為必然的選擇。如何誘導(dǎo)非牙源性干細(xì)胞牙向分化,建立效果明確且穩(wěn)定的誘導(dǎo)體系,是解決牙齒再生細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題的關(guān)鍵。來(lái)源于骨髓的間充質(zhì)細(xì)胞(英文全稱為Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,簡(jiǎn)稱BMMSCs)是一種具有較強(qiáng)增殖能力和多向誘導(dǎo)分化潛能的細(xì)胞,大量研究表明BMMSCs已被廣泛應(yīng)用于骨組織工程。除此之外,BMMSC具有分化成其他組織甚至其他胚層細(xì)胞的可塑性,而且BMMSCs易于獲取,可以從患者自身獲得,避免了免疫排斥的問(wèn)題[10]。人牙本質(zhì)基質(zhì)材料(英文全稱為human Treated Dentin Matrix,簡(jiǎn)稱h TDM)已有研究證明是理想的牙組織工程的支架材料,人牙本質(zhì)基質(zhì)材料本身是一種細(xì)胞外基質(zhì),對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性,并且具有良好的生物學(xué)性能。同時(shí)h TDM含有利于成牙的生長(zhǎng)因子,這樣為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了一個(gè)良好的微環(huán)境,本研究在以上研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)h TDM復(fù)合BMMSCs的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探究其BMMSCs的成牙能力。為組織工程方法實(shí)現(xiàn)牙根再生的研究提供依據(jù)。目的在以上研究的基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)利用改良的處理方法處理離體牙,從而得到新型人牙本質(zhì)基質(zhì)生物支架材料;在體外探究人牙本質(zhì)基質(zhì)材料對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)、增值分化等生物學(xué)特性的影響,并且通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)探究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在人牙本質(zhì)基質(zhì)生物支架材料作用下,是否能夠進(jìn)行成牙方面的分化。為以后的牙根再生的研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。材料和方法1.本實(shí)驗(yàn)用骨髓從臨床進(jìn)行正頜外科手術(shù)修復(fù)頜面部畸形的患者取得,經(jīng)過(guò)患者同意后,于術(shù)中切取患者上下頜骨時(shí)收集剩余的骨組織。采用組織塊培養(yǎng)的方法,進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)。2.本研究通過(guò)改良的梯度脫礦方法對(duì)人牙本質(zhì)基質(zhì)進(jìn)行處理后得到的TDM,掃描電鏡下牙本質(zhì)小管充分暴露,并且管間和管周牙本質(zhì)纖維組織變的十分疏松。3.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的方法對(duì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞表面分子進(jìn)行鑒定。4.利用細(xì)胞免疫組化的方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞進(jìn)行來(lái)源鑒定。5.通過(guò)成脂、成骨實(shí)驗(yàn),探究本實(shí)驗(yàn)獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力6.光鏡觀察TDM于骨髓間充后生物學(xué)特征的改變。7.采用real time PCR檢測(cè)經(jīng)過(guò)h TDM浸提液誘導(dǎo)之后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成牙基因的表達(dá)的情況。8.h TDM復(fù)合BMMSCs移植到裸鼠皮下,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究TDM探究BMMSCs的成牙能力結(jié)果1采用組織塊培養(yǎng)法將頜骨剪碎的骨塊接種培養(yǎng)瓶,96h后首次換液,一周后光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)頜骨組織塊周圍有細(xì)胞長(zhǎng)出,絕大部分為梭形、多邊形。然后細(xì)胞逐漸增多。傳代后細(xì)胞的形態(tài)變得更加多樣化。2將收到的新鮮的離體牙制作與牙根相似外形的TDM,材料約有1mm厚,表面形態(tài)十分光滑而且規(guī)則。電鏡下可見(jiàn)牙本質(zhì)小管充分暴露,并且管間和管周牙本質(zhì)纖維組織變的十分疏松。3培養(yǎng)細(xì)胞制作細(xì)胞爬片,固定后采用Vimentin、CK14進(jìn)行免疫組化染色,確定細(xì)胞來(lái)源。Vimentin染色成陽(yáng)性、CK14染色成陰性4網(wǎng),流式細(xì)胞儀上機(jī),進(jìn)行細(xì)胞表面CD分子檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)包括:CD105、D31、CD34、CD90、CD73、CD25、CD26、CD146、CD8b等。5人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂、成骨實(shí)驗(yàn)表明人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有較強(qiáng)的成脂成骨能力。6經(jīng)過(guò)h TDM作用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,TDM有利于細(xì)胞的生長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目增加,細(xì)胞在材料表面有良好的附著。7采用real-time PCR定量檢測(cè)TDM的浸提液誘導(dǎo)h BMSCs3、7天后,h BMSCs的成牙相關(guān)基因表達(dá)明顯增加。8 h TDM復(fù)合BMMSCs移植到裸鼠皮下2個(gè)月后,發(fā)現(xiàn)TDM表面出現(xiàn)新生的牙本質(zhì)。結(jié)論1.采用組織塊培養(yǎng)法能夠分離得到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于不表達(dá)上皮源性相關(guān)蛋白,表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的相關(guān)標(biāo)志,并且表達(dá)干細(xì)胞特性。3.h TDM能夠促進(jìn)h BMSCs的牙向分化。
【關(guān)鍵詞】：人牙本質(zhì)基質(zhì)材料 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 牙組織工程學(xué) 生物牙根
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R783.1
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 英語(yǔ)縮略詞索引15-16
• 引言16-19
• 第一部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定19-28
• 1 前言19
• 2 材料和方法19-24
• 3 結(jié)果24-26
• 4 討論26-27
• 5 結(jié)論27-28
• 第二部分 天然支架材料及誘導(dǎo)微環(huán)境的制備和構(gòu)建28-35
• 1 前言28-29
• 2 材料和方法29-30
• 3 結(jié)果30-31
• 4 討論31-34
• 5 結(jié)論34-35
• 第三部分 人牙本質(zhì)基質(zhì)材料復(fù)合人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)的研究35-45
• 1 前言35-36
• 2 材料和方法36-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-44
• 5 結(jié)論44-45
• 全文總結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 綜述 利用組織工程技術(shù)構(gòu)建生物牙根的研究進(jìn)展51-65
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果65-66
• 致謝66

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本文編號(hào)：712331