本文關(guān)鍵詞：bmper、microRNA-23a對(duì)斑馬魚(yú)顱面軟骨發(fā)育的影響及nkx2.3轉(zhuǎn)基因魚(yú)的構(gòu)建

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【摘要】：顱面畸形是一種常見(jiàn)的胎兒出生缺陷,是由于顱面骨發(fā)育異常造成的結(jié)構(gòu)紊亂。研究表明,BMP信號(hào)通路和nicroRNAs在斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育中具有重要功能,盡管一些BMP信號(hào)的調(diào)控分子和：nicroRNAs已經(jīng)被證明與胚胎的軟骨發(fā)育有關(guān),但是它們?cè)谲浌前l(fā)育過(guò)程中的功能還所知甚少。Bmper是BMP信號(hào)通路中位于細(xì)胞外的調(diào)控分子。bmper基因的突變,在人類中導(dǎo)致一種稱為DSD(Diaphonospondylodysostosis)的罕見(jiàn)隱性遺傳的骨骼發(fā)育不良疾病,患病嬰兒具有脊柱嚴(yán)重骨化、體節(jié)缺陷、腎臟結(jié)構(gòu)異常等特征。在本研究中,通過(guò)對(duì)bmper時(shí)空表達(dá)譜的研究,我們發(fā)現(xiàn)bmper在斑馬魚(yú)的頭部咽區(qū)部位有顯著表達(dá)。通過(guò)反義寡核背酸morpholino敲低bmper的表達(dá),結(jié)果導(dǎo)致斑馬魚(yú)的顱面骨大部分缺失。然后,我們利用Cas9/gRNA技術(shù)構(gòu)建bmper突變體,希望在突變體中觀察到與注射norpholino類似的表型。miR-23a屬于miR-27a、miR-23a、miR-24-2家族的一員。通過(guò)反義寡核苷酸morpholino敲低miR-23a的表達(dá),發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)咽部軟骨大部分缺失。進(jìn)一步,我們利用Tg(sox10:EGFP)轉(zhuǎn)基因魚(yú)研究miR-23a對(duì)咽軟骨發(fā)育影響,發(fā)現(xiàn)其影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和軟骨前體細(xì)胞的分化。另外,咽囊的發(fā)育對(duì)斑馬魚(yú)的顱面骨形成具有重要影響,為了深入研究斑馬魚(yú)的咽囊發(fā)育,我們利用To12轉(zhuǎn)座子和Cre-loxP技術(shù)構(gòu)建Tg(nkx2.3:CreERT2)和Tg(nkx2.3:EGFP-CAAX)轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系。綜上所述,本研究表明,敲低bmper、miR-23a的表達(dá)嚴(yán)重影響斑馬魚(yú)的顱面骨發(fā)育,我們期望通過(guò)進(jìn)一步的深入研究,揭示這兩個(gè)基因影響顱面骨發(fā)育的具體機(jī)制,為與顱面骨畸形相關(guān)疾病的診斷和分析提供科學(xué)依據(jù)。我們成功構(gòu)建了Tg(nkx2.3:CreERT2)和Tg(nkx2.3:EGFP-CAAX)轉(zhuǎn)基因魚(yú),為與咽囊相關(guān)的研究工作提供了重要的工具。
【關(guān)鍵詞】：bmper miR-23a 顱面軟骨 nkx2.3轉(zhuǎn)基因魚(yú) CreERT2 綠色熒光蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R782;Q78
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 緒論9-32
• 1.1 斑馬魚(yú)顱面骨的發(fā)育過(guò)程9-15
• 1.1.1 斑馬魚(yú)的顱面骨結(jié)構(gòu)9-11
• 1.1.2 神經(jīng)嵴細(xì)胞11-14
• 1.1.3 顱面骨形成過(guò)程中的細(xì)胞聚集和分化14-15
• 1.2 咽弓的形成15-16
• 1.3 斑馬魚(yú)的咽囊發(fā)育16-17
• 1.4 TGF-β超家族和BMP信號(hào)通路17-21
• 1.4.1 TGF-β超家族18-19
• 1.4.2 BMP信號(hào)通路19-21
• 1.5 bmper的研究進(jìn)展21-23
• 1.6 MicroRNAs在顱面骨發(fā)育過(guò)程中的作用23-25
• 1.6.1 MicroRNAs的形成及作用機(jī)制23-25
• 1.6.2 MicroRNAs在骨發(fā)育過(guò)程中的功能研究進(jìn)展25
• 1.6.3 microRNA-23a的研究進(jìn)展25
• 1.7 Tol2轉(zhuǎn)座子及其在斑馬魚(yú)中的應(yīng)用25-27
• 1.8 Cre重組酶介導(dǎo)的種系追蹤27-30
• 1.9 本課題研究的內(nèi)容和意義30-32
• 第二章 材料與方法32-40
• 2.1 斑魚(yú)胚胎的培養(yǎng)32
• 2.2 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)座酶mRNA體外合成32-33
• 2.3 Morpholino33-34
• 2.4 顯微注射與轉(zhuǎn)基因魚(yú)構(gòu)建34-35
• 2.5 原位雜交35-39
• 2.5.1 RNA探針制備35-36
• 2.5.2 胚胎的準(zhǔn)備36
• 2.5.3 整胚原位雜交36-38
• 2.5.4 原位雜交溶液配制38-39
• 2.6 阿爾新藍(lán)染色39-40
• 第三章 bmper對(duì)斑馬魚(yú)顱面軟骨形成的影響40-45
• 3.1 bmper的保守性分析和時(shí)空表達(dá)譜的鑒定40-41
• 3.2 敲低bmper影響斑馬魚(yú)胚胎顱面軟骨的發(fā)育41-42
• 3.3 斑馬魚(yú)bmper突變體的構(gòu)建42-45
• 第四章 miR-23a對(duì)斑馬魚(yú)咽軟骨形成的影響45-49
• 4.1 敲低miR-23a引起斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育缺陷45-46
• 4.2 敲低miR-23a影響斑馬魚(yú)顱面骨的發(fā)育46
• 4.3 敲低miR-23a影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移46-47
• 4.4 Tg(sox10：EGFP)轉(zhuǎn)基因魚(yú)咽軟骨發(fā)育過(guò)程的觀察47-48
• 4.5 本章小結(jié)48-49
• 第五章 咽囊細(xì)胞追蹤系統(tǒng)的構(gòu)建49-52
• 5.1 斑馬魚(yú)胚胎的注射及篩選49-50
• 5.2 F_0代斑馬魚(yú)的篩選及熒光表達(dá)分析50-52
• 第六章 Tg(nkx2.3：EGFP-CAAX)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的構(gòu)建52-54
• 6.1 斑馬魚(yú)胚胎的注射及篩選52
• 6.2 F_0代斑馬魚(yú)的篩選及熒光表達(dá)分析52-54
• 第七章 結(jié)論54-55
• 7.1 bmper對(duì)斑馬魚(yú)顱面骨發(fā)育的影響54
• 7.2 microRNA-23a影響斑馬魚(yú)的咽弓發(fā)育54
• 7.3 nkx2.3轉(zhuǎn)基因魚(yú)的構(gòu)建54-55
• 參考文獻(xiàn)55-64
• 致謝64

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本文編號(hào)：704305