發(fā)布時間：2017-08-08 09:12

  本文關(guān)鍵詞：TGFβ3通過調(diào)控ΔNp63的表達影響腭部發(fā)育過程中腭周皮細胞脫落的作用研究

  更多相關(guān)文章： 腭周皮細胞 TGFβ3 △Np63 IRF6 腭部發(fā)育

【摘要】：研究背景及研究目的唇腭裂是口腔頜面部最常見的先天性發(fā)育缺陷,從遺傳學角度可以將其分為：非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂[non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P)]、非綜合征性單純腭裂[non-syndromic cleft palate only (NSCPO)]、綜合征性唇裂伴或不伴腭裂[syndromic cleft lip with or without cleft palate (CL/P)]以及綜合征性單純腭裂[syndromic cleft palate only (CPO)]。其中,非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂(NSCL/P)和非綜合征性單純腭裂(NSCPO)是一類不伴發(fā)其他系統(tǒng)或器官畸形的疾病,是不在綜合征之內(nèi)的單純唇裂、唇裂合并腭裂、或單純腭裂的總稱,此類唇腭裂是由復雜的遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而導致的多基因、多因素遺傳性疾病。腭部發(fā)育包括腭突(腭板)的垂直向生長、抬起、水平向生長、接觸和融合等一系列過程。腭部的正常發(fā)育需要機體對腭部上皮細胞和間充質(zhì)細胞所涉及的關(guān)鍵生理過程,諸如細胞生長、細胞增殖、程序性細胞死亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[epithelial-mesenchymal transition (EMT)]、細胞遷移和信號傳導等進行精準的調(diào)控。在機體調(diào)控腭部發(fā)育的諸多環(huán)節(jié)中,任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題或調(diào)控偏差,都將有可能導致腭裂的發(fā)生。已有充分證據(jù)表明,在腭部發(fā)育過程中,腭板間充質(zhì)細胞成分和上皮細胞成分參與的多項生物活動均與轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)β家族有著重要的聯(lián)系。目前對哺乳動物的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TGFβ家族至少包括四個亞型(TGFβ1, 2,3和TGFβ1β2).而前三者均在小鼠腭部發(fā)育的早期即有所表達：胚胎第11.0-11.5天,腭突自上頜突長出并垂直向下生長,此時在兩腭突的上皮細胞中可檢測到TGFβ3的表達；胚胎第12.0-12.5天,兩腭突繼續(xù)呈垂直向生長,其上皮和間充質(zhì)細胞中均可檢測至TGFβ1和TGFβ2的表達；胚胎第13.0-13.5天,腭突(腭板)抬起至呈水平方向,腭板上皮細胞中可檢測至TGFβ3的高表達及TGFβ1的表達,間充質(zhì)細胞中則呈現(xiàn)TGFβ1的少量散在表達和TGFβ2的強而廣泛的表達；胚胎第14.0-14.5天,在經(jīng)歷水平向生長后,兩腭突(腭板)即將相互接觸,TGFβ1,2和3在腭突中均有所表達；胚胎第15.0-15.5天,兩腭突(腭板)互相接觸并開始融合(該過程可能涉及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及細胞凋亡等機制),TGFβ1 3表達量明顯降低,而TGFβ2在腭中縫兩側(cè)的間充質(zhì)組織中則有較強的表達;胚胎第16.0-16.5天,腭突在中線處融合,TGFβ1的表達僅局限于腭突和鼻中隔的骨化區(qū),TGFβ2在腭部中線附近的間充質(zhì)中散在表達,而TGFβ3主要在間充質(zhì)細胞中表達。以上證據(jù)充分表明TGFβ家族可能在腭部發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。TGFβ基因敲除小鼠模型的表現(xiàn)型亦提示TGFβ在腭部發(fā)育過程中的關(guān)鍵作用。TGFβ1和TGFβ2基因敲除小鼠在出生之前即死亡,因此不能用作腭部發(fā)育的研究模型；而TGFβ3基因敲除小鼠出生時總是表現(xiàn)出非綜合征性單純腭裂,并于出生后24小時內(nèi)死亡,是研究腭部發(fā)育的較為理想的動物模型之一。動物實驗中,外源性給予胎鼠TGFβ3可以糾正TGFβ3基因敲除小鼠的唇腭裂缺陷,進一步提示TGFβ可能參與腭部發(fā)育過程的調(diào)控。在腭裂研究的各種動物模型中,兩腭板正常抬起后因無法接觸融合而引發(fā)的腭裂是最常見的一種類型。在口腔各部位的上皮細胞中,周皮細胞作為一層保護性細胞,在發(fā)育早期可有效防止鄰近的組織在未成熟階段發(fā)生錯誤性的粘附和融合,進而避免一系列的發(fā)育畸形,腭部上皮細胞亦是如此。在腭部發(fā)育過程中,腭板表面被覆單層立方狀的基底細胞樣上皮細胞,其逐步層化而形成位于表層的扁平狀上皮細胞,即為腭周皮細胞,腭周皮細胞在腭部發(fā)育早期可防止腭板過早的與鄰近組織發(fā)生融合。然而在腭部發(fā)育的后期,當左、右兩腭板抬起、經(jīng)歷水平向生長,并于中線處相互接觸時,腭周皮細胞的適時脫落,則成為兩腭板互相粘附并形成腭中縫上皮帶的必要條件之一。反言之,腭周皮細胞繼續(xù)存留將可能導致腭裂的發(fā)生。然而基底層腭板上皮細胞如何保持單層立方狀細胞結(jié)構(gòu),以及其層化形成腭周皮細胞的機制尚不清楚,腭部發(fā)育后期腭周皮細胞脫落的具體調(diào)節(jié)機制也尚待研究。TGFβ3在腭板融合及腭周皮細胞脫落的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。盡管TGF β 3在腭中線上皮細胞(Medial edge epithelia, MEE)中的表達規(guī)律與腭周皮細胞形成和脫落的規(guī)律在時間上呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性,但其在腭中線上皮細胞的分化和腭周皮細胞脫落中的具體作用機制尚未得到系統(tǒng)的研究。目前已有研究表明,借助于干擾素調(diào)節(jié)因子6 (Interferon Regulatory Factor 6, IRF6)的調(diào)節(jié),△Np63可有效促進上皮細胞的分化及周皮細胞的活化。有趣的是,ΔNp63、TGFβ3和IRF6三種基因敲除小鼠模型中,新生小鼠均伴有腭裂,且皆因其雙側(cè)腭板未能融合所致(三型基因敲除小鼠腭裂形成的具體原因各不相同),進一步表明這些基因在調(diào)節(jié)腭部上皮細胞分化的過程中可能發(fā)揮著重要的作用。盡管上述三種基因敲除小鼠的腭裂表現(xiàn)及其發(fā)病機制均已有相應的文獻支持,但迄今為止,有關(guān)三者在腭部發(fā)育過程中的協(xié)同作用機制尚未見文獻報道。在此,我們假設(shè)TGFβ3通過調(diào)節(jié)IRF6和△Np63的表達水平而影響腭周皮細胞的形成和脫落,從而參與腭部發(fā)育過程的調(diào)控。實驗中分別對TGF β 3基因敲除型、△Np63基因敲除型和野生型(wild-type,WT)小鼠胚胎(胎鼠)的頭顱冠狀切片及由野生型小鼠取材并行原代培養(yǎng)得到的MEE細胞,進行了生化分析、基因活性分析和蛋白表達分析等相關(guān)的研究,以驗證該假設(shè)成立與否,進而揭示TGFβ3、IRF6和△Np63在腭部發(fā)育過程中調(diào)控腭周皮細胞形成和脫落的具體作用機制。研究方法1.對胚胎第14.5天[dpc (days post coitum)]的TGFβ3基因敲除型,△Np63基因敲除型及野生型小鼠頭顱冠狀石蠟切片進行HE染色,以從形態(tài)學分析此時期各型胎鼠的腭板結(jié)構(gòu)及細胞組成。2.應用掃描電子顯微鏡(SEM)對胚胎第14.25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面進行掃描,以從微觀上觀察腭板表面上皮細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點。3.應用原子力顯微鏡(AFM)結(jié)合針尖增強拉曼(TERS)光譜術(shù),對胚胎第14.25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面進行掃描,以納米級分辨率獲得腭板表面形貌結(jié)構(gòu)信息及表面粗糙度信息。4.對腭部發(fā)育不同時期的TGFβ3基因敲除型,△Np63基因敲除型及野生型小鼠頭顱冠狀石蠟切片進行免疫組織化學染色和免疫熒光雙重染色,以從蛋白水平確定腭部發(fā)育過程中,腭板間充質(zhì)細胞和上皮細胞中相關(guān)蛋白的表達情況。5.采用原代培養(yǎng)的野生型小鼠腭中線上皮細胞(MEE),研究TGFβ基因?qū)Α鱊p63和IRF6表達的調(diào)節(jié)作用。用不同劑量(0.5,1.0,3.0,5.0和10. Ong/ml)的外源性重組人類TGFβ3 (rTGFβ3)處理腭中線上皮細胞,并于不同時間點(12小時,24小時,36小時和48小時)分別提取蛋白質(zhì)和mRNA,并分別采用Western Blot技術(shù)檢測△Np63和IRF6蛋白的表達變化,采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測△Np63和IRF6 mRNA的水平變化。6.以pGL3作為載體,構(gòu)建小鼠重組△Np63螢光素酶報告基因質(zhì)粒,用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MEE細胞后,采用外源性重組人類TGFβ3(rTGFβ3)處理細胞,通過重組質(zhì)粒螢光素酶活性分析,檢測△Np63啟動子活性。結(jié)果1.小鼠頭顱冠狀石蠟切片的HE染色,掃描電子顯微鏡(SEM)分析及原子力顯微鏡(AFM)分析結(jié)果,均顯示腭板抬起至水平向以后,隨著腭板的生長,至二者相互接觸前,野生型(WT)胎鼠腭板表面的腭周皮細胞逐漸發(fā)生皺縮、突起、變圓等改變,直至后期自腭板表面脫落,因此其腭板表面較粗糙,且兩腭板接觸后形成腭中縫上皮帶；而TGFβ3基因敲除(-/-)型胎鼠的腭周皮細胞始終存留于腭板表面,腭板表面光滑,表層細胞健康,且在兩腭板接觸后,接觸區(qū)的雙層腭板上皮細胞之間尚嵌有一層扁平狀的腭周皮細胞,因此兩腭板接觸不緊密。2.小鼠頭顱冠狀石蠟切片的免疫組化染色及免疫熒光染色結(jié)果顯示：a.腭部發(fā)育后期,野生型胎鼠腭板上皮細胞表面尚有一層不連續(xù)的扁平狀細胞,且有凋亡小體檢出；而TGFβ3基因敲除型胎鼠腭板表面的扁平狀細胞排列緊密,且無細胞凋亡狀況。b.腭部發(fā)育過程中,腭板最表層的單層扁平狀細胞確為腭周皮細胞,因其表達腭周皮細胞特異性標記蛋白。c.在兩腭板水平生長至即將接觸之前,野生型胎鼠腭板接觸融合區(qū)的腭板上皮細胞核內(nèi)△Np63的表達明顯降低,而TGFβ3基因敲除型胎鼠的腭中線上皮細胞內(nèi)△Np63呈現(xiàn)持續(xù)的高表達,提示腭板發(fā)育后期TGFβ3可能通過下調(diào)△Np63的表達水平,從而促進腭周皮細胞脫落。d.腭部發(fā)育早期,△Np63基因敲除型胎鼠的腭板表面腭周皮細胞缺如,但是在腭板抬起至水平向以后,腭板的鼻腔側(cè)迅速與鼻中隔區(qū)域發(fā)生融合；而腭板的口腔側(cè)上皮出現(xiàn)少量腭周皮細胞。e.IRF6在腭板內(nèi)的分布與表達情況,均不受TGFβ3或者△Np63基因敲除與否的影響。3. Western Blot及實時定量PCR檢測結(jié)果顯示,采用外源性TGFβ3對原代培養(yǎng)的MEE細胞進行處理,可明顯降低△Np63的表達水平,但IRF6的表達未受影響。4.螢光素酶活性分析結(jié)果顯示,TGFβ3處理被轉(zhuǎn)染的MEE細胞,可明顯降低△Np63的啟動子活性。結(jié)論1.兩腭板水平生長至互相接觸前,WT胎鼠腭板表面的腭周皮細胞脫落,兩腭板互相融合,形成完整的腭部結(jié)構(gòu)；而TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮細胞仍然存留,阻礙了腭板的融合,引發(fā)腭裂；2. TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮細胞之所以存留,與IRF6和△Np63的持續(xù)高表達有關(guān)；腭周皮細胞的凋亡和脫落依賴于TGFβ3對△Np63的功能性抑制作用,與IRF6的表達無關(guān)；3.ΔNp63 KO胎鼠發(fā)生腭裂與TGFβ3 KO胎鼠源于完全不同的機制,前者是由于腭板抬起后與鼻中隔結(jié)構(gòu)發(fā)生過早的融合,阻礙了腭板的水平生長和接觸而引起腭裂；4.腭部發(fā)育過程中,TGFβ3對△Np63發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用：腭部發(fā)育初期,IRF6的轉(zhuǎn)錄激活(可能由Wnt/TGFβ1/Ephrin/Notch/Jag2等介導)可有效上調(diào)△Np63的表達,進而促進腭周皮細胞的形成及維持；而腭部發(fā)育后期,TGFβ3大量表達,抑制△Np63的表達,導致腭周皮細胞脫落,以利于后期腭板接觸后發(fā)生融合。
【關(guān)鍵詞】：腭周皮細胞 TGFβ3 △Np63 IRF6 腭部發(fā)育
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R782.2
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 符號說明19-22
• 前言22-36
• 參考文獻30-36
• 材料與方法36-62
• 參考文獻61-62
• 結(jié)果62-74
• 參考文獻72-74
• 討論74-82
• 參考文獻79-82
• 全文結(jié)論82-84
• 附圖表84-112
• 致謝112-116
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄116-118
• 外文論文118-140
• 學位論文評閱及答辯情況表140

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本文編號：639198