發(fā)布時(shí)間：2017-08-08 09:12

  本文關(guān)鍵詞：TGFβ3通過(guò)調(diào)控ΔNp63的表達(dá)影響腭部發(fā)育過(guò)程中腭周皮細(xì)胞脫落的作用研究

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【摘要】：研究背景及研究目的唇腭裂是口腔頜面部最常見(jiàn)的先天性發(fā)育缺陷,從遺傳學(xué)角度可以將其分為：非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂[non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P)]、非綜合征性單純腭裂[non-syndromic cleft palate only (NSCPO)]、綜合征性唇裂伴或不伴腭裂[syndromic cleft lip with or without cleft palate (CL/P)]以及綜合征性單純腭裂[syndromic cleft palate only (CPO)]。其中,非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂(NSCL/P)和非綜合征性單純腭裂(NSCPO)是一類不伴發(fā)其他系統(tǒng)或器官畸形的疾病,是不在綜合征之內(nèi)的單純唇裂、唇裂合并腭裂、或單純腭裂的總稱,此類唇腭裂是由復(fù)雜的遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而導(dǎo)致的多基因、多因素遺傳性疾病。腭部發(fā)育包括腭突(腭板)的垂直向生長(zhǎng)、抬起、水平向生長(zhǎng)、接觸和融合等一系列過(guò)程。腭部的正常發(fā)育需要機(jī)體對(duì)腭部上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞所涉及的關(guān)鍵生理過(guò)程,諸如細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、程序性細(xì)胞死亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[epithelial-mesenchymal transition (EMT)]、細(xì)胞遷移和信號(hào)傳導(dǎo)等進(jìn)行精準(zhǔn)的調(diào)控。在機(jī)體調(diào)控腭部發(fā)育的諸多環(huán)節(jié)中,任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題或調(diào)控偏差,都將有可能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。已有充分證據(jù)表明,在腭部發(fā)育過(guò)程中,腭板間充質(zhì)細(xì)胞成分和上皮細(xì)胞成分參與的多項(xiàng)生物活動(dòng)均與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)β家族有著重要的聯(lián)系。目前對(duì)哺乳動(dòng)物的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),TGFβ家族至少包括四個(gè)亞型(TGFβ1, 2,3和TGFβ1β2).而前三者均在小鼠腭部發(fā)育的早期即有所表達(dá)：胚胎第11.0-11.5天,腭突自上頜突長(zhǎng)出并垂直向下生長(zhǎng),此時(shí)在兩腭突的上皮細(xì)胞中可檢測(cè)到TGFβ3的表達(dá)；胚胎第12.0-12.5天,兩腭突繼續(xù)呈垂直向生長(zhǎng),其上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中均可檢測(cè)至TGFβ1和TGFβ2的表達(dá)；胚胎第13.0-13.5天,腭突(腭板)抬起至呈水平方向,腭板上皮細(xì)胞中可檢測(cè)至TGFβ3的高表達(dá)及TGFβ1的表達(dá),間充質(zhì)細(xì)胞中則呈現(xiàn)TGFβ1的少量散在表達(dá)和TGFβ2的強(qiáng)而廣泛的表達(dá)；胚胎第14.0-14.5天,在經(jīng)歷水平向生長(zhǎng)后,兩腭突(腭板)即將相互接觸,TGFβ1,2和3在腭突中均有所表達(dá)；胚胎第15.0-15.5天,兩腭突(腭板)互相接觸并開(kāi)始融合(該過(guò)程可能涉及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞凋亡等機(jī)制),TGFβ1 3表達(dá)量明顯降低,而TGFβ2在腭中縫兩側(cè)的間充質(zhì)組織中則有較強(qiáng)的表達(dá);胚胎第16.0-16.5天,腭突在中線處融合,TGFβ1的表達(dá)僅局限于腭突和鼻中隔的骨化區(qū),TGFβ2在腭部中線附近的間充質(zhì)中散在表達(dá),而TGFβ3主要在間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。以上證據(jù)充分表明TGFβ家族可能在腭部發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。TGFβ基因敲除小鼠模型的表現(xiàn)型亦提示TGFβ在腭部發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵作用。TGFβ1和TGFβ2基因敲除小鼠在出生之前即死亡,因此不能用作腭部發(fā)育的研究模型；而TGFβ3基因敲除小鼠出生時(shí)總是表現(xiàn)出非綜合征性單純腭裂,并于出生后24小時(shí)內(nèi)死亡,是研究腭部發(fā)育的較為理想的動(dòng)物模型之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,外源性給予胎鼠TGFβ3可以糾正TGFβ3基因敲除小鼠的唇腭裂缺陷,進(jìn)一步提示TGFβ可能參與腭部發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。在腭裂研究的各種動(dòng)物模型中,兩腭板正常抬起后因無(wú)法接觸融合而引發(fā)的腭裂是最常見(jiàn)的一種類型。在口腔各部位的上皮細(xì)胞中,周皮細(xì)胞作為一層保護(hù)性細(xì)胞,在發(fā)育早期可有效防止鄰近的組織在未成熟階段發(fā)生錯(cuò)誤性的粘附和融合,進(jìn)而避免一系列的發(fā)育畸形,腭部上皮細(xì)胞亦是如此。在腭部發(fā)育過(guò)程中,腭板表面被覆單層立方狀的基底細(xì)胞樣上皮細(xì)胞,其逐步層化而形成位于表層的扁平狀上皮細(xì)胞,即為腭周皮細(xì)胞,腭周皮細(xì)胞在腭部發(fā)育早期可防止腭板過(guò)早的與鄰近組織發(fā)生融合。然而在腭部發(fā)育的后期,當(dāng)左、右兩腭板抬起、經(jīng)歷水平向生長(zhǎng),并于中線處相互接觸時(shí),腭周皮細(xì)胞的適時(shí)脫落,則成為兩腭板互相粘附并形成腭中縫上皮帶的必要條件之一。反言之,腭周皮細(xì)胞繼續(xù)存留將可能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。然而基底層腭板上皮細(xì)胞如何保持單層立方狀細(xì)胞結(jié)構(gòu),以及其層化形成腭周皮細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚,腭部發(fā)育后期腭周皮細(xì)胞脫落的具體調(diào)節(jié)機(jī)制也尚待研究。TGFβ3在腭板融合及腭周皮細(xì)胞脫落的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。盡管TGF β 3在腭中線上皮細(xì)胞(Medial edge epithelia, MEE)中的表達(dá)規(guī)律與腭周皮細(xì)胞形成和脫落的規(guī)律在時(shí)間上呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性,但其在腭中線上皮細(xì)胞的分化和腭周皮細(xì)胞脫落中的具體作用機(jī)制尚未得到系統(tǒng)的研究。目前已有研究表明,借助于干擾素調(diào)節(jié)因子6 (Interferon Regulatory Factor 6, IRF6)的調(diào)節(jié),△Np63可有效促進(jìn)上皮細(xì)胞的分化及周皮細(xì)胞的活化。有趣的是,ΔNp63、TGFβ3和IRF6三種基因敲除小鼠模型中,新生小鼠均伴有腭裂,且皆因其雙側(cè)腭板未能融合所致(三型基因敲除小鼠腭裂形成的具體原因各不相同),進(jìn)一步表明這些基因在調(diào)節(jié)腭部上皮細(xì)胞分化的過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。盡管上述三種基因敲除小鼠的腭裂表現(xiàn)及其發(fā)病機(jī)制均已有相應(yīng)的文獻(xiàn)支持,但迄今為止,有關(guān)三者在腭部發(fā)育過(guò)程中的協(xié)同作用機(jī)制尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在此,我們假設(shè)TGFβ3通過(guò)調(diào)節(jié)IRF6和△Np63的表達(dá)水平而影響腭周皮細(xì)胞的形成和脫落,從而參與腭部發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)TGF β 3基因敲除型、△Np63基因敲除型和野生型(wild-type,WT)小鼠胚胎(胎鼠)的頭顱冠狀切片及由野生型小鼠取材并行原代培養(yǎng)得到的MEE細(xì)胞,進(jìn)行了生化分析、基因活性分析和蛋白表達(dá)分析等相關(guān)的研究,以驗(yàn)證該假設(shè)成立與否,進(jìn)而揭示TGFβ3、IRF6和△Np63在腭部發(fā)育過(guò)程中調(diào)控腭周皮細(xì)胞形成和脫落的具體作用機(jī)制。研究方法1.對(duì)胚胎第14.5天[dpc (days post coitum)]的TGFβ3基因敲除型,△Np63基因敲除型及野生型小鼠頭顱冠狀石蠟切片進(jìn)行HE染色,以從形態(tài)學(xué)分析此時(shí)期各型胎鼠的腭板結(jié)構(gòu)及細(xì)胞組成。2.應(yīng)用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)胚胎第14.25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面進(jìn)行掃描,以從微觀上觀察腭板表面上皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。3.應(yīng)用原子力顯微鏡(AFM)結(jié)合針尖增強(qiáng)拉曼(TERS)光譜術(shù),對(duì)胚胎第14.25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面進(jìn)行掃描,以納米級(jí)分辨率獲得腭板表面形貌結(jié)構(gòu)信息及表面粗糙度信息。4.對(duì)腭部發(fā)育不同時(shí)期的TGFβ3基因敲除型,△Np63基因敲除型及野生型小鼠頭顱冠狀石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光雙重染色,以從蛋白水平確定腭部發(fā)育過(guò)程中,腭板間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。5.采用原代培養(yǎng)的野生型小鼠腭中線上皮細(xì)胞(MEE),研究TGFβ基因?qū)Α鱊p63和IRF6表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。用不同劑量(0.5,1.0,3.0,5.0和10. Ong/ml)的外源性重組人類TGFβ3 (rTGFβ3)處理腭中線上皮細(xì)胞,并于不同時(shí)間點(diǎn)(12小時(shí),24小時(shí),36小時(shí)和48小時(shí))分別提取蛋白質(zhì)和mRNA,并分別采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)△Np63和IRF6蛋白的表達(dá)變化,采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)△Np63和IRF6 mRNA的水平變化。6.以pGL3作為載體,構(gòu)建小鼠重組△Np63螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MEE細(xì)胞后,采用外源性重組人類TGFβ3(rTGFβ3)處理細(xì)胞,通過(guò)重組質(zhì)粒螢光素酶活性分析,檢測(cè)△Np63啟動(dòng)子活性。結(jié)果1.小鼠頭顱冠狀石蠟切片的HE染色,掃描電子顯微鏡(SEM)分析及原子力顯微鏡(AFM)分析結(jié)果,均顯示腭板抬起至水平向以后,隨著腭板的生長(zhǎng),至二者相互接觸前,野生型(WT)胎鼠腭板表面的腭周皮細(xì)胞逐漸發(fā)生皺縮、突起、變圓等改變,直至后期自腭板表面脫落,因此其腭板表面較粗糙,且兩腭板接觸后形成腭中縫上皮帶；而TGFβ3基因敲除(-/-)型胎鼠的腭周皮細(xì)胞始終存留于腭板表面,腭板表面光滑,表層細(xì)胞健康,且在兩腭板接觸后,接觸區(qū)的雙層腭板上皮細(xì)胞之間尚嵌有一層扁平狀的腭周皮細(xì)胞,因此兩腭板接觸不緊密。2.小鼠頭顱冠狀石蠟切片的免疫組化染色及免疫熒光染色結(jié)果顯示：a.腭部發(fā)育后期,野生型胎鼠腭板上皮細(xì)胞表面尚有一層不連續(xù)的扁平狀細(xì)胞,且有凋亡小體檢出；而TGFβ3基因敲除型胎鼠腭板表面的扁平狀細(xì)胞排列緊密,且無(wú)細(xì)胞凋亡狀況。b.腭部發(fā)育過(guò)程中,腭板最表層的單層扁平狀細(xì)胞確為腭周皮細(xì)胞,因其表達(dá)腭周皮細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白。c.在兩腭板水平生長(zhǎng)至即將接觸之前,野生型胎鼠腭板接觸融合區(qū)的腭板上皮細(xì)胞核內(nèi)△Np63的表達(dá)明顯降低,而TGFβ3基因敲除型胎鼠的腭中線上皮細(xì)胞內(nèi)△Np63呈現(xiàn)持續(xù)的高表達(dá),提示腭板發(fā)育后期TGFβ3可能通過(guò)下調(diào)△Np63的表達(dá)水平,從而促進(jìn)腭周皮細(xì)胞脫落。d.腭部發(fā)育早期,△Np63基因敲除型胎鼠的腭板表面腭周皮細(xì)胞缺如,但是在腭板抬起至水平向以后,腭板的鼻腔側(cè)迅速與鼻中隔區(qū)域發(fā)生融合；而腭板的口腔側(cè)上皮出現(xiàn)少量腭周皮細(xì)胞。e.IRF6在腭板內(nèi)的分布與表達(dá)情況,均不受TGFβ3或者△Np63基因敲除與否的影響。3. Western Blot及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,采用外源性TGFβ3對(duì)原代培養(yǎng)的MEE細(xì)胞進(jìn)行處理,可明顯降低△Np63的表達(dá)水平,但I(xiàn)RF6的表達(dá)未受影響。4.螢光素酶活性分析結(jié)果顯示,TGFβ3處理被轉(zhuǎn)染的MEE細(xì)胞,可明顯降低△Np63的啟動(dòng)子活性。結(jié)論1.兩腭板水平生長(zhǎng)至互相接觸前,WT胎鼠腭板表面的腭周皮細(xì)胞脫落,兩腭板互相融合,形成完整的腭部結(jié)構(gòu)；而TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮細(xì)胞仍然存留,阻礙了腭板的融合,引發(fā)腭裂；2. TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮細(xì)胞之所以存留,與IRF6和△Np63的持續(xù)高表達(dá)有關(guān)；腭周皮細(xì)胞的凋亡和脫落依賴于TGFβ3對(duì)△Np63的功能性抑制作用,與IRF6的表達(dá)無(wú)關(guān)；3.ΔNp63 KO胎鼠發(fā)生腭裂與TGFβ3 KO胎鼠源于完全不同的機(jī)制,前者是由于腭板抬起后與鼻中隔結(jié)構(gòu)發(fā)生過(guò)早的融合,阻礙了腭板的水平生長(zhǎng)和接觸而引起腭裂；4.腭部發(fā)育過(guò)程中,TGFβ3對(duì)△Np63發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用：腭部發(fā)育初期,IRF6的轉(zhuǎn)錄激活(可能由Wnt/TGFβ1/Ephrin/Notch/Jag2等介導(dǎo))可有效上調(diào)△Np63的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腭周皮細(xì)胞的形成及維持；而腭部發(fā)育后期,TGFβ3大量表達(dá),抑制△Np63的表達(dá),導(dǎo)致腭周皮細(xì)胞脫落,以利于后期腭板接觸后發(fā)生融合。
【關(guān)鍵詞】：腭周皮細(xì)胞 TGFβ3 △Np63 IRF6 腭部發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R782.2
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-19
• 符號(hào)說(shuō)明19-22
• 前言22-36
• 參考文獻(xiàn)30-36
• 材料與方法36-62
• 參考文獻(xiàn)61-62
• 結(jié)果62-74
• 參考文獻(xiàn)72-74
• 討論74-82
• 參考文獻(xiàn)79-82
• 全文結(jié)論82-84
• 附圖表84-112
• 致謝112-116
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄116-118
• 外文論文118-140
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表140

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本文編號(hào)：639198