本文關鍵詞：凋亡蛋白抑制因子5在牙周炎中的作用和機制的初步探索

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【摘要】：目的:本研究旨在通過體外細胞實驗比較健康人及慢性牙周炎患者的健康牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts,HGFs)的細胞活性及細胞凋亡相關基因的差異,分析兩種不同來源的牙齦組織中凋亡蛋白抑制因子5(apoptosis protein inhibitor 5,API5)及細胞凋亡相關因子的變化,siRNA技術檢測API5對HGFs細胞活性和凋亡的影響,以及探索其可能的調節(jié)機制,為闡明牙周炎的發(fā)病機制以及探索新的治療方法提供實驗依據。方法:1.經患者知情同意后,收集健康人及慢性牙周炎患者在拔除埋伏阻生的第三磨牙時健康牙齦組織,立即置入含有100U雙抗的PBS液中反復沖洗,將牙齦組織剪成約1mm3的小塊,采用組織塊貼壁法體外培養(yǎng)HGFs,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀況。2.健康人及慢性牙周炎HGFs體外培養(yǎng)不同時間后檢測其細胞活性;體外培養(yǎng)2d、4d后實時熒光定量PCR(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)檢測B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)的表達及分析兩者的比值變化。3.經患者知情同意后,收集健康人及慢性牙周炎患者的牙齦組織,立即置入含有RNAlater保存液的EP管中,采用Trizol法提取組織總RNA,按試劑盒操作反轉錄合成cDNA。對從總RNA中提取的cDNA進行real-time PCR,檢測細胞凋亡相關因子API5、Bcl-2、Bax、B細胞淋巴瘤-xl(B-cell lymphoma-extra large,Bcl-xl)、細胞周期蛋白E 1(cyclin E1,CCNE1)的mRNA表達水平。4.siRNA API5轉染健康人HGFs,提取細胞總蛋白進行蛋白免疫印跡實驗,檢測siRNA API5的轉染效率。5.siRNA API5轉染細胞后采用MTT和流式細胞儀檢測siRNA API5對細胞活性、細胞凋亡的影響。設空白對照組、陰性對照、siRNA API5組。6.siRNA API5轉染細胞后采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測HGFs中API5對凋亡相關基因表達的影響。設空白對照組、陰性對照、siRNA API5組。結果:1.采用組織塊貼壁法,健康組和慢性牙周炎組均成功培養(yǎng)出HGFs,傳代后細胞趨于一致的長梭形并呈放射狀排列,生長旺盛。慢性牙周炎組HGFs細胞活性低于健康組,在細胞培養(yǎng)第4d、6d、8d時細胞活性明顯降低(P0.05),細胞凋亡增強。2.在細胞培養(yǎng)2d后,與健康組對比,慢性牙周炎組HGFs中Bax的mRNA水平升高,但Bcl-2的mRNA水平在兩組間無差別,慢性牙周炎組Bcl-2/Bax的比值較健康組降低(P0.05)。在細胞培養(yǎng)4d后,慢性牙周炎組HGFs中Bcl-2和Bax的mRNA水平均高于健康組,但Bax的mRNA水平升高更明顯,Bcl-2/Bax的比值明顯低于健康組(P0.05)。3.慢性牙周炎組牙齦組織中API5、Bcl-2的mRNA表達水平低于健康組(P0.05),Bcl-xl的mRNA表達雖然有下降趨勢,但無統(tǒng)計學意義(P0.05);Bax、CCNE1在慢性牙周炎組牙齦組織中的表達高于健康組(P0.05)。4.蛋白免疫印跡實驗結果表明siRNA API5成功轉染至HGFs,抑制效率49.54%。siRNA API5轉染后,HGFs細胞活性明顯減低,細胞凋亡增加(P0.05)。siRNA API5轉染HGFs后,在第0d、1d、3d時,API5、Bcl-2以及CCNE1的表達明顯低于對照組(P0.05),Bcl-xl的表達在第3d時明顯下降(P0.05),但在第0d、1d無統(tǒng)計學差異(P0.05),Bax的表達顯著高于對照組(P0.05),Bcl-2/Bax的比值明顯低于對照組(P0.05)。結論:1.與健康人相比,慢性牙周炎患者HGFs的細胞活性降低,細胞凋亡增加,說明慢性牙周炎患者自身牙周組織修復能力差,具有牙周炎易感性。2.抑制API5導致HGFs細胞活性降低,細胞凋亡增加,而且在慢性牙周炎牙齦組織中API5表達下降,說明API5參與牙周炎發(fā)病的細胞凋亡機制。3.抑制API5可以降低HGFs中Bcl-2、Bcl-xl以及CCNE1的表達,升高Bax的表達,同時下調Bcl-2/Bax的比值,說明API5通過調節(jié)細胞凋亡相關因子的表達,參與慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程。
【關鍵詞】：牙周炎 細胞凋亡 凋亡蛋白抑制因子5 B細胞淋巴瘤-2 Bcl-2相關X蛋白 B細胞淋巴瘤-xl 細胞周期蛋白E1
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.42
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-16
• 研究現狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、慢性牙周炎患者和健康人牙齦成纖維細胞細胞活性和凋亡相關因子Bcl-2、Bax的比較16-26
• 1.1 對象和方法16-21
• 1.1.1 主要設備和儀器16-17
• 1.1.2 主要試劑17
• 1.1.3 主要試劑的配制17-18
• 1.1.4 研究對象和方法18-21
• 1.2 結果21-23
• 1.2.1 人牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)21
• 1.2.2 健康組與慢性牙周炎組HGFs細胞活性的比較21-22
• 1.2.3 健康組與慢性牙周炎組HGFs中凋亡相關因子的比較22-23
• 1.3 討論23-25
• 1.4 小結25-26
• 二、健康人及慢性牙周炎患者牙齦組織中API5及其他凋亡相關因子的差異性比較26-35
• 2.1 對象和方法26-29
• 2.1.1 主要設備和儀器26-27
• 2.1.2 主要試劑27
• 2.1.3 研究對象和方法27-29
• 2.2 結果29-30
• 2.2.1 各組間年齡、性別統(tǒng)計學分析29
• 2.2.2 real-time PCR檢測API5及其他凋亡相關因子的表達29-30
• 2.3 討論30-34
• 2.4 小結34-35
• 三、抑制API5對人牙齦成纖維細胞細胞活性及凋亡的影響35-44
• 3.1 對象和方法35-40
• 3.1.1 主要設備和儀器35-36
• 3.1.2 主要實驗試劑36
• 3.1.3 主要試劑的配制36-37
• 3.1.4 實驗分組37
• 3.1.5 細胞蛋白提取和蛋白質免疫印跡實驗37-39
• 3.1.6 MTT檢測siRNA API5轉染后HGFs的細胞活性39
• 3.1.7 流式細胞儀檢測siRNA API5轉染后HGFs的細胞凋亡39-40
• 3.1.8 統(tǒng)計學分析40
• 3.2 結果40-41
• 3.2.1 蛋白免疫印跡檢測API5的表達40
• 3.2.2 siRNA API5轉染后對HGFs細胞活性的影響40-41
• 3.2.3 siRNA API5轉染后對HGFs細胞凋亡的影響41
• 3.3 討論41-43
• 3.4 小結43-44
• 四、抑制API5對人牙齦成纖維細胞中細胞凋亡相關因子的影響44-52
• 4.1 對象和方法44-46
• 4.1.1 主要設備和儀器44-45
• 4.1.2 主要實驗試劑45
• 4.1.3 主要試劑的制備45
• 4.1.4 實驗分組45
• 4.1.5 RT-PCR半定量檢測凋亡相關因子的表達45-46
• 4.1.6 統(tǒng)計學分析46
• 4.2 結果46-49
• 4.2.1 RT-PCR半定量檢測凋亡相關基因的表達46-49
• 4.3 討論49-51
• 4.4 小結51-52
• 結論52-53
• 參考文獻53-59
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明59-60
• 綜述 凋亡抑制因子5與細胞凋亡關系的研究進展60-66
• 綜述參考文獻64-66
• 致謝66

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本文編號：637496