發(fā)布時間：2017-07-31 18:01

  本文關(guān)鍵詞：MS-275對人牙髓干細胞增殖和分化的影響

  更多相關(guān)文章： HDAC MS-275 仿生多孔納米明膠支架材料 人牙髓干細胞 增殖 分化

【摘要】：近年來,齲病作為臨床上的常見病之一,越來越引起人們的關(guān)注,齲病的形成主要是由于細菌及其毒性產(chǎn)物侵害牙本質(zhì),造成牙體硬組織脫礦,最終形成缺損。而當細菌和其致病因子毒力較強且持續(xù)作用時,則會通過牙本質(zhì)小管導(dǎo)致牙髓組織的損傷。在受到嚴重刺激后,牙髓中的間充質(zhì)干細胞即牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)會遷移并黏附到受損組織,在多種因素調(diào)控下,向成牙本質(zhì)樣細胞分化并產(chǎn)生牙本質(zhì)基質(zhì),進行組織修復(fù),這為牙齒的修復(fù)再生奠定了堅實的細胞生物學(xué)基礎(chǔ)。組蛋白去乙�；�(histone deacetylase,HDAC)是一類催化組蛋白去除乙�；^程的酶類,在調(diào)控機體乙酰化水平中發(fā)揮重要作用,而機體的乙�；脚c腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系,而且在干細胞增殖,分化的調(diào)控中有重要作用。我們前期研究結(jié)果表明,在h DPSCs成骨/成牙分化過程中,HDAC1的基因表達量隨時間增加顯著下調(diào),提示HDAC1可能參與調(diào)控h DPSCs的分化過程。MS-275(Entinostat,SNDX-275)是HDAC1的特異性抑制劑,屬于苯甲酰胺類,它可以選擇性的抑制第一類HDAC,特別是HDAC1,調(diào)控組蛋白的乙�；�,從而影響腫瘤相關(guān)基因的表達水平,與其他種類的HDACs抑制劑相比,MS-275具有細胞毒性低和抗腫瘤效率高等優(yōu)點,因此成為臨床上一類重要的抗腫瘤藥物。MS-275能夠通過調(diào)控細胞周期蛋白而抑制腫瘤細胞的增殖,同時在胚胎干細胞的成神經(jīng)分化中發(fā)揮重要作用。組織工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織器官再生中得到了廣泛應(yīng)用,而各種材料的合理應(yīng)用成為組織工程技術(shù)中重要的環(huán)節(jié),目前納米材料在組織修復(fù)再生中應(yīng)用廣泛,而仿生多孔納米纖維明膠支架材料(nano-fibrous gelatin(NF-gelatin)hybrid scaffolds)是一種新型的三維立體結(jié)構(gòu)的支架材料,在物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成上都與自然形成的牙本質(zhì)相類似,這種三維結(jié)構(gòu)能夠促進干細胞的粘附、增殖、遷移和分化能力,在組織工程應(yīng)用中有很大前景,因此我們選用該材料進行進一步研究。本課題旨在成功分離、培養(yǎng)人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)的基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)外實驗研究MS-275對h DPSCs增殖和分化能力的影響,進一步明確HDAC1在h DPSCs增殖和分化中的作用,為牙齒損傷修復(fù)與再生提供理新的思路與實驗依據(jù)。主要研究成果如下:1.h DPSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定我們?nèi)?8-22周歲年輕患者因正畸或阻生拔除的健康恒牙,用組織塊與酶消化聯(lián)合法分離、培養(yǎng)h DPSCs,再通過有限稀釋法挑取單細胞克隆,擴大培養(yǎng)。我們通過流式細胞儀鑒定細胞表面標記物,通過成骨、成脂誘導(dǎo)后茜素紅染色和油紅O染色檢測細胞的多向分化能力,證明我們成功分離和培養(yǎng)出h DPSCs。2.MS-275對體外培養(yǎng)的h DPSCs增殖及分化的研究我們前期研究結(jié)果表明,在h DPSCs成骨/成牙分化過程中,HDAC1的基因表達量隨時間的增加顯著下調(diào),為了進一步探索HDAC1在h DPSCs中的作用,我們選擇其特異性抑制劑MS-275作為研究對象。我們選取20μM MS-275、2μM MS-275、0.2μM MS-275誘導(dǎo)二維平面的h DPSCs,通過MTT檢測發(fā)現(xiàn):不同濃度的MS-275均對h DPSCs的增殖有抑制作用,且20μM MS-275對細胞有毒性。而經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后,與對照組相比,2μM MS-275、0.2μM MS-275均能促進h DPSCs鈣結(jié)節(jié)的形成和成骨/成牙相關(guān)基因和蛋白ALP、DSPP、OCN和BSP的表達,且2μM MS-275促進h DPSCs成骨/成牙向分化的作用更強。3.MS-275對在仿生多孔納米明膠支架材料上培養(yǎng)的h DPSCs增殖及分化的研究我們將h DPSCs與20μM MS-275、2μM MS-275、0.2μM MS-275處理后的納米明膠支架材料相復(fù)合,通過MTT檢測發(fā)現(xiàn):在三維立體環(huán)境下,所測不同濃度的MS-275均對h DPSCs的增殖有抑制作用,且20μM MS-275對細胞有毒性。而經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后,2μM MS-275、0.2μM MS-275均能促進h DPSCs鈣結(jié)節(jié)的形成和成骨/成牙相關(guān)基因和蛋白ALP、DSPP、OCN、BSP的表達,且2μM MS-275促進h DPSCs成骨/成牙向分化的作用更明顯。將h DPSCs與材料復(fù)合物進行裸鼠皮下移植結(jié)果顯示:與對照組比較,HE染色和Masson’s染色表明2μM MS-275能夠顯著促進材料上膠原纖維的生成,Von Kossa染色顯示2μM MS-275能夠促進礦化硬組織的形成。X線片及Micro CT三維結(jié)構(gòu)重建及數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明2μM MS-275能夠促進礦化硬組織的形成。綜上所述,我們的研究證實,一定濃度的HDAC1特異性抑制劑MS-275能夠抑制h DPSCs的增殖而促進h DPSCs的成骨/成牙分化,表明HDAC1在調(diào)控h DPSCs的增殖和分化中發(fā)揮重要所用,這為未來牙髓損傷修復(fù)和牙齒再生提供了新的思路和實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：HDAC MS-275 仿生多孔納米明膠支架材料 人牙髓干細胞 增殖 分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.1
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-15
• 文獻回顧15-23
• 實驗一h DPSCs的培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定23-31
• 1 材料23-24
• 2. 方法24-26
• 3 結(jié)果26-28
• 4 討論28-31
• 實驗二MS-275對體外培養(yǎng)的h DPSCs增殖及成骨/成牙分化的影響31-44
• 1 材料32-33
• 2 方法33-38
• 3 結(jié)果38-41
• 4 討論41-44
• 實驗三MS-275對在仿生多孔納米明膠支架材料上培養(yǎng)的h DPSCs增殖及成骨/成牙分化的影響44-58
• 1 材料44-45
• 2 方法45-49
• 3 結(jié)果49-55
• 4 討論55-58
• 小結(jié)58-59
• 參考文獻59-71
• 個人簡歷和研究成果71-72
• 致謝72-73

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本文編號：600390