本文關(guān)鍵詞：腺病毒介導(dǎo)的VEGF和BMP2基因?qū)Φ谌谘辣举|(zhì)形成的作用

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【摘要】：對于深齲和意外穿髓等患者的治療,如何保存其患牙的牙髓活力是口腔科醫(yī)生面臨的重要挑戰(zhàn)。組織學(xué)上,牙體組織由3種硬組織釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)和1種軟組織牙髓構(gòu)成,其中,牙本質(zhì)作為牙體組織主要成分,在保護牙髓、支撐釉質(zhì)起重要作用。齲病、外傷、磨耗等引起的物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)作用通過牙本質(zhì)小管和成牙本質(zhì)細(xì)胞突起而損傷牙髓,輕則引起牙髓的反應(yīng)性變化、重則引起牙髓的感染和壞死。其中,成牙本質(zhì)細(xì)胞形成第三期牙本質(zhì)是牙髓的主要防御反應(yīng),通過形成第三期牙本質(zhì)來保護牙髓免受進(jìn)一步損傷。因此,如何促進(jìn)損傷牙髓形成第三期牙本質(zhì)是防止病變進(jìn)一步發(fā)展和保存患牙活力重要的科學(xué)問題。第三期牙本質(zhì)形成的過程包括牙髓干細(xì)胞的遷移、增殖和向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化,并分泌牙本質(zhì)基質(zhì)。其中牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化是修復(fù)性牙本質(zhì)形成中的重要過程,多種因素、細(xì)胞因子和信號通路參與和調(diào)控了這個過程。生長因子通過促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖、分化和功能,進(jìn)而促進(jìn)第三期牙本質(zhì)的形成。研究表明,受傷的牙髓細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)刺激血管生成,通過提高Runx2(Runt-related transcription factor 2)蛋白水平,引起牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)表達(dá)等機制促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化,進(jìn)而促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。VEGF是一個強有力的促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子,具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原活性,在體內(nèi)能夠刺激血管的發(fā)生,增加血管的滲透性。因此,應(yīng)用VEGF有可能通過促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化、形成第三期牙本質(zhì),以保護牙髓。骨形成蛋白2(BMP2),屬于TGF-β家族的蛋白質(zhì),是一個自分泌蛋白。BMP2具有通過Smad 1/5、p38a MAPK等信號通路促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和修復(fù)性牙本質(zhì)的形成的作用。成牙本質(zhì)細(xì)胞能產(chǎn)生和分泌BMP2,直接影響分泌和刺激鄰近的成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和分化導(dǎo)致牙本質(zhì)形成。有研究通過促進(jìn)BMP2蛋白表達(dá)或應(yīng)用外源性BMP2蛋白實現(xiàn)形成修復(fù)性牙本質(zhì)或第三期牙本質(zhì)。而BMP2蛋白質(zhì)昂貴,如果應(yīng)用表達(dá)BMP2蛋白的病毒載體有可能通過BMP信號通路促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的功能,形成第三期牙本質(zhì)以保護牙髓。針對第三期牙本質(zhì)在牙體牙髓病發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用,根據(jù)VEGF、BMP2在牙髓干細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖分化中的作用,在腺病毒介導(dǎo)VEGF和BMP2促成骨作用研究的基礎(chǔ)上,提出了我們的研究,即應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)VEGF和BMP2基因轉(zhuǎn)染牙髓干細(xì)胞,并檢測對牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的影響,并且將腺病毒介導(dǎo)的VEGF和BMP2應(yīng)用于蓋髓的動物實驗,研究其對第三期牙本質(zhì)形成的影響,這將為臨床上應(yīng)用VEGF和BMP2治療深齲和意外穿髓奠定基礎(chǔ)。首先,我們從人脫落乳牙牙髓中采用組織塊法經(jīng)酶消化提取、分離和培養(yǎng)牙髓細(xì)胞(人乳牙h DPCs)。所有實驗均使用第3代牙髓細(xì)胞。在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含IBMX0.5mmol/L、地塞米松1μmol/L、胰島素10mg/L、消炎痛200μmol/L)內(nèi)培養(yǎng)35天,油紅O染色陽性。在礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,茜素紅染色陽性。表示所培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞中含有干細(xì)胞,并有一定的分化能力。第二,將攜增強型綠色熒光蛋白的腺病毒載體(Ad CMV-EGFP)以不同的病毒數(shù)量(0、400、800、1000 particles/cell)轉(zhuǎn)導(dǎo)第3代人乳牙h DPCs。在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的24小時就有EGFP的表達(dá),Ad CMV-EGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率隨病毒數(shù)量的增加而逐漸增加。在病毒量為1000 particles/cell時,細(xì)胞增殖沒有明顯受到影響,細(xì)胞的形態(tài)無明顯變化,病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)3d后,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可達(dá)70%以上。在以后的實驗中,轉(zhuǎn)染Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2時也選擇該濃度作為轉(zhuǎn)導(dǎo)條件進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天的細(xì)胞提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴增、2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察到h VEGF和h BMP2表達(dá)增加,表明Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2已成功轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并且有m RNA水平的轉(zhuǎn)錄。第三,按照病毒數(shù)量為1000particles/cell轉(zhuǎn)導(dǎo),將Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2對人乳牙h DPCs的作用分別與Ad CMV-EGFP組進(jìn)行了一系列細(xì)胞分子學(xué)方面的比較。與Ad CMV-EGFP對照組相比,實驗組Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)后,在礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含抗壞血酸50mg/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、地塞米松10-8mol/L)中,培養(yǎng)14天和28天進(jìn)行茜素紅染色,有更多的礦化結(jié)節(jié)形成。礦化誘導(dǎo)7天、14天和21天均檢測到細(xì)胞堿性磷酸酶活性增高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。礦化誘導(dǎo)3天、7天和14天提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-QPCR,結(jié)果顯示,參與骨生成/牙本質(zhì)發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)大幅度增加,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ad CMV-h VEGF在7天時差異更為顯著,Ad CMV-h BMP2則在14天時更顯著。第四,在體內(nèi),我們制備了第三期牙本質(zhì)修復(fù)的動物模型。將Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2置于大鼠磨牙窩洞內(nèi),采用組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察h VEGF和h BMP2應(yīng)用對第三期性牙本質(zhì)形成的作用。體內(nèi)實驗結(jié)果同樣表明,它們可促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞增殖和新血管形成,并極大地提高了牙髓中第三期牙本質(zhì)的形成。本研究采用腺病毒載體介導(dǎo)h VEGF或h BMP2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人乳牙h DPCs,研究了腺病毒載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)h DPCs的可行性,以及h VEGF或h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)對h DPCs功能的影響。我們的體外和體內(nèi)的數(shù)據(jù)表明,Ad CMV-h VEGF或Ad CMV-h BMP2可促進(jìn)第三期牙本質(zhì)的形成,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。本研究的創(chuàng)新點在于將腺病毒為載體的h VEGF或h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)用于第三期牙本質(zhì)形成和修復(fù)的研究。
【關(guān)鍵詞】：VEGF BMP2 第三期牙本質(zhì) 牙髓細(xì)胞 礦化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第1章 文獻(xiàn)綜述14-22
• 1 第三期牙本質(zhì)形成的細(xì)胞因素15-16
• 2 參與第三期牙本質(zhì)形成的信號通路16-20
• 3 生物材料對第三期牙本質(zhì)形成的影響20-22
• 第2章 脫落乳牙牙髓細(xì)胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化22-30
• 2.1 材料與方法22-25
• 2.1.1 實驗主要儀器和試劑22-23
• 2.1.2 實驗材料與方法23-25
• 2.2 結(jié)果25-27
• 2.2.1 人乳牙h DPCs的培養(yǎng)25
• 2.2.2 人乳牙h DPCs生長曲線25
• 2.2.3 人乳牙h DPCs成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)25-27
• 2.3 討論27-30
• 第3章 腺病毒介導(dǎo)的h VEGF基因?qū)Φ谌谘辣举|(zhì)形成的作用30-48
• 3.1 材料與方法31-37
• 3.1.1 實驗主要儀器和試劑31-32
• 3.1.2 實驗方法32-37
• 3.2 結(jié)果37-43
• 3.2.1 Ad CMV-EGFP和Ad CMV-h VEGF轉(zhuǎn)導(dǎo)人乳牙h DPCs37-39
• 3.2.2 Ad CMV-h VEGF轉(zhuǎn)導(dǎo)對人乳牙h DPCs礦化能力的影響39-40
• 3.2.3 Ad CMV-h VEGF轉(zhuǎn)導(dǎo)對人乳牙h DPCs成牙本質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響40-41
• 3.2.4 Ad CMV-h VEGF轉(zhuǎn)導(dǎo)對大鼠磨牙第三期牙本質(zhì)形成的作用41-43
• 3.3 討論43-48
• 第4 章腺病毒介導(dǎo)的h BMP2基因?qū)Φ谌谘辣举|(zhì)形成的作用48-58
• 4.1 材料與方法49-50
• 4.1.1 實驗主要儀器和試劑49
• 4.1.2 實驗方法49-50
• 4.2 結(jié)果50-54
• 4.2.1 Ad CMV-h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)人乳牙h DPCs50
• 4.2.2 Ad CMV-h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)對人乳牙h DPCs礦化能力的影響50-51
• 4.2.3 Ad CMV-h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)對人乳牙h DPCs成牙本質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響51-52
• 4.2.4 Ad CMV-h BMP2轉(zhuǎn)導(dǎo)對大鼠磨牙第三期牙本質(zhì)形成的作用52-54
• 4.3 討論54-58
• 第5章 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-78
• 作者簡介及在學(xué)期間取得的科研成果78-80
• 致謝80

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本文編號：587984