本文關(guān)鍵詞：利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建可逆性永生化人牙囊細胞系的研究

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【摘要】：目的：牙囊是包裹在發(fā)育牙胚表面的結(jié)締組織,牙囊將發(fā)育成為牙周的相關(guān)組織和結(jié)構(gòu)。牙囊細胞是存在牙囊中的細胞,其已被證明在體內(nèi)體外均具有多向分化潛能。但牙囊細胞存在組織來源有限,組織中細胞含量少,細胞在體外增殖困難等特點。因此如何有效的獲得足夠量的細胞、并保持細胞生物學(xué)特性的一致性和穩(wěn)定性,是組織工程中急待解決的問題。永生化作為獲得細胞系的重要手段在組織工程中己廣泛應(yīng)用。但以往的永生化方法存在永生化效率低、有潛在安全隱患等問題。PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染方法相比,具有操作簡便、效率高、整合位點易確定、轉(zhuǎn)座基因可長期穩(wěn)定表達等優(yōu)點。因此,本實驗旨在采用piggyBac可逆性永生化系統(tǒng)建立人牙囊細胞系,并對獲得的永生化及去永生化牙囊細胞的增殪活性、多向分化潛能進行全面系統(tǒng)的研究。標準的間充質(zhì)干細胞的多向分化能力通常有限,如何誘導(dǎo)干細胞進行定向分化是研究的熱點內(nèi)容之一,特定的生長因子則是誘導(dǎo)干細胞進行特定方向分化的重要因素之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)和過氧化物酶增殖物激活受體γ21(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2, PPARy2)分別是最常用的成骨和成脂誘導(dǎo)分化因子。而目前未見關(guān)于BMP9及PPARy2對牙囊細胞定向分化能力影響的相關(guān)研究。因此本實驗旨在分析BMP9對原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞的成骨和成軟骨能力的影響,以及PPARy2對原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞成脂能力的影響。方法：1.采用有限稀釋法獲得單克隆原代牙囊細胞2.采用piggyac可逆性永生化系統(tǒng)獲得永生化及去永生化牙囊細胞3.采用CCK8,細胞計數(shù)等方法比較原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞增殖活性。4.采用細胞免疫熒光染色及流式細胞儀檢測原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞表面標記物表達。5.采用端粒重復(fù)序列擴增程序及石英晶體微天平兩種方法檢測原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞端粒酶活性。6.采用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、成骨基因及蛋白表達分析原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞體外成骨分化潛能。7.采用阿利新藍染色、成軟骨基因及蛋白表達分析原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞體外成軟骨分化潛能。8.采用脂紅染色、成脂基因及蛋白表達分析原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞體外成脂分化潛能。9.采用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、阿利新藍染色、相關(guān)基因及蛋白表達分析分析BMP9對原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞體外成骨、成軟骨分化能力影響。10.采用脂紅染色、成脂基因及蛋白表達分析PPARγ對原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞體外成脂分化能力影響。11.裸鼠皮下異位植入牙囊細胞后進行HE染色,MASSON染色分析原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞及去永生化牙囊細胞體內(nèi)分化能力。結(jié)果：1.永生化牙囊細胞增殖活性高于原代牙囊細胞,而去永生化牙囊細胞增殖增殖活性與原代牙囊細胞相似。2.原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞均表達牙囊細胞表面標記物。3.原代牙囊細胞端粒酶活性隨傳代降低,永生化牙囊細胞端粒酶活性增強,且保持在較高水平,不隨傳代降低,去永生化牙囊細胞端粒酶活性與原代牙囊細胞類似。4.原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、、去永生化牙囊細胞成骨誘導(dǎo)分化后堿性磷酸酶活性增強、茜素紅染色陽性、成骨相關(guān)基因及蛋白表達升高。5.原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞成軟骨誘導(dǎo)分化后阿利新藍染色陽性、成軟骨相關(guān)基因及蛋白表達升高。6.原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞成脂誘導(dǎo)分化后脂紅染色陽性、成脂相關(guān)基因及蛋白表達升高。7.BMP9感染后,原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞的堿性磷酸酶活性、茜素紅染色、成骨成軟骨相關(guān)基因及蛋白表達均較正常誘導(dǎo)組升高。8. PPARy2感染后,原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞的脂紅染色、成脂相關(guān)基因及蛋白表達均較正常誘導(dǎo)組升高。9.原代牙囊細胞、永生化牙囊細胞、去永生化牙囊細胞可在裸鼠背部生成骨樣軟骨樣組織。結(jié)論：1.采用piggybac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以有效的建立永生化牙囊細胞系,所獲得的永生化牙囊細胞增殖活性快、多向分化能力強,可廣泛應(yīng)用于組織工程研究中。2.BMP9可有效促進牙囊細胞成骨、成軟骨分化.3. PPARy2可有效促進牙囊細胞成脂分化。
【關(guān)鍵詞】：牙囊細胞 永生化 轉(zhuǎn)座 多向分化
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-18
• 第一章 piggyBac可逆性永生化牙囊細胞系的建立18-57
• 1 材料和方法18-33
• 2 結(jié)果33-45
• 3 討論45-48
• 4 參考文獻48-57
• 第二章 永生化牙囊細胞多向分化潛能鑒定57-89
• 第一節(jié) 永生化牙囊細胞體外多向分化潛能鑒定57-81
• 1 材料與方法57-67
• 2 結(jié)果67-78
• 3 討論78-81
• 第二節(jié) 牙囊細胞體內(nèi)多向分化潛能鑒定81-84
• 1 材料和方法81-83
• 2 結(jié)果83-84
• 3 討論84
• 參考文獻84-89
• 全文總結(jié)89-90
• 文獻綜述90-100
• 參考文獻94-100
• 致謝100-101
• 攻讀博士期間發(fā)表文章101

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 金作林,林珠;集落刺激因子在人牙囊細胞中的表達[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2002年02期

2 谷海晶,凌均h，

本文編號：565975