本文關(guān)鍵詞：生物鐘基因Per2對人口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控作用

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【摘要】：第一部分口腔鱗癌細(xì)胞株培養(yǎng)和口腔黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)目的:獲得純化的口腔黏膜上皮細(xì)胞,并對口腔黏膜上皮細(xì)胞是否純化進(jìn)行檢測。方法:收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科對頜面整形患者手術(shù)中切除的口腔正常粘膜,于1.0u/ml dispaseⅡ中4℃消化過夜。顯微鏡下分離粘膜組織的上皮層,0.25%胰酶消化,用口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基OKM接種于鼠尾膠包被六孔板中。置于37℃,95%濕度,5%CO2培養(yǎng)箱。4 d傳一代,選取第2代細(xì)胞提取m RNA、蛋白,第3代細(xì)胞制作細(xì)胞爬片。取口腔粘膜上皮細(xì)胞細(xì)胞爬片進(jìn)行角蛋白染色,一抗角蛋白抗體4℃過夜。二抗工作液常溫孵1 h?顯微鏡下分別用×40,×100,×200觀察,拍照?結(jié)果:口腔粘膜上皮細(xì)胞呈鋪路石樣,角蛋白染色結(jié)果表明陽性率100%,證實(shí)為純化的上皮細(xì)胞.結(jié)論:無血清篩選和上皮分離結(jié)合的方法可以獲得純化的口腔黏膜上皮細(xì)胞。第二部分生物鐘基因Per2在不同口腔鱗癌細(xì)胞株及正�？谇火つど掀ぜ�(xì)胞中的表達(dá)目的:檢測Per2在不同口腔鱗癌細(xì)胞株及正常口腔黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá),為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。方法:采用QPCR和WB來檢測Per2在上皮細(xì)胞、Tca8113和SCC15細(xì)胞中m RNA和蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0數(shù)據(jù)軟件對多組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,結(jié)果以mean±SD表示,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)果:Per2在上皮細(xì)胞、Tca8113和SCC15細(xì)胞中m RNA和蛋白的表達(dá):在上皮細(xì)胞、Tca8113和SCC15細(xì)胞中Per2 m RNA的表達(dá)分別為2.41±0.21,1.00±0.12和0.9±0.17;Per2蛋白表達(dá)的灰度值比值分別為:2.87±0.26,1.11±0.13和0.98±0.32。結(jié)論:Tca8113和SCC15細(xì)胞中Per2 m RNA和蛋白表達(dá)量均顯著低于上皮細(xì)胞(P0.05),表明在OSCC中Per2低表達(dá).第三部分Per2干擾質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證目的:通過sh RNA的方法干擾Per2,并檢測干擾后的Per2 m RNA和蛋白的表達(dá),建立Per2干擾的細(xì)胞模型,為進(jìn)一步的研究做準(zhǔn)備。方法:Per2真核干擾質(zhì)粒(p GPU6-Per2-sh RNA-I~III)和空載質(zhì)粒(p GPU6-Control-sh RNA)購買自成都冷泉水生物技術(shù)有限公司.細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipo2000(Invitrogen,USA)和OPI-MEM(Gibco,USA)介導(dǎo),細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24-48 h提取RNA,48 h后提取蛋白。將實(shí)驗(yàn)分為5組:Per2-sh RNA-I、Per2-sh RNA-II和Per2-sh RNA-III組分別為轉(zhuǎn)染p GPU6-Per2-sh RNA-I,p GPU6-Per2-sh RNA-II和p GPU6-Per2-sh RNA-III質(zhì)粒的Tca8113細(xì)胞。Control-sh RNA組(對照組)為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的Tca8113細(xì)胞。Tca8113組(空白對照組)為未做任何處理的Tca8113細(xì)胞。采用QPCR和WB來檢測Per2在各組中m RNA和蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0數(shù)據(jù)軟件對多組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,結(jié)果以mean±SD表示,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.m RNA的表達(dá)分別為1.67±0.30、1.45±0.34、1.00±0.13、3.01±0.11和3.20±0.52。Per2蛋白表達(dá)的灰度值比值分別為1.52±0.11、1.22±0.15、0.87±0.21、3.18±0.52和3.21±0.42。Per2的m RNA和蛋白表達(dá)量在Tca8113和Control-sh RNA組中無明顯差別(P0.05),Per2-sh RNA-Ⅲ組顯著低于Tca8113和Control-sh RNA組(P0.05)。結(jié)論:Per2-sh RNA-Ⅲ組的Per2沉默效果最好,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)作為實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果:Per2-sh RNA-Ⅰ~Ⅲ、Control-sh RNA和Tca8113組細(xì)胞中Per2第四部分Per2干擾后細(xì)胞的細(xì)胞周期分布.增殖和凋亡的變化及對細(xì)胞周期Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用目的:本研究通過對人口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)細(xì)胞內(nèi)的Per2基因干擾,檢測Per2干擾后細(xì)胞周期,增殖,凋亡的改變,并全面檢測Cyclins-CDKsCKIs網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中各重要分子的改變情況,以進(jìn)一步闡明Per2與癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系.方法:將Per2真核干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Tca8113細(xì)胞中,用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡的變化,QPCR檢測Cyclin A2,Cyclin B1,C-myc,Cyclin D1,Cyclin E,P53,CDK1,CDK2,CDK4,CDK6,Rb1,E2F1,Wee1,cdc25,p16和p21的m RNA表達(dá)量的變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0數(shù)據(jù)軟件對多組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,結(jié)果以mean±SD表示,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)果:與Tca8113和Control-sh RNA組相比,Per2-sh RNA-Ⅲ組中G1/G0期的細(xì)胞數(shù)顯著降低(P0.05),細(xì)胞增殖指數(shù)顯著增高(P0.05),而凋亡指數(shù)顯著降低(P0.05),Tca8113和Control-sh RNA組細(xì)胞的G1/G0期細(xì)胞數(shù),增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)無差異(P0.05)。與Tca8113和Control-sh RNA組相比,Per2-sh RNA-Ⅲ組中p53,p16和p21 m RNA的表達(dá)水平顯著降低(P0.05),而Cyclin A2,Cyclin B1,Cyclin D1,CDK4,CDK6和E2F1 m RNA的表達(dá)水平顯著增高(P0.05),C-myc,Cyclin E,CDK1,CDK2,cdc25,Wee1和Rb1 m RNA的表達(dá)水平均無差異(P0.05)?結(jié)論:Per2干擾后,Tca8113癌細(xì)胞中Cyclin A2,Cyclin B1,Cyclin D1,CDK4,CDK6,E2F1 m RNA的表達(dá)水平顯著增高,而p53,p16,p21 m RNA的表達(dá)水平顯著降低。細(xì)胞增殖水平顯著增高,凋亡水平顯著下降,細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生改變。本研究從轉(zhuǎn)錄水平證明了生物鐘基因Per2對Cyclins-CDKs-CKIs細(xì)胞周期分子網(wǎng)絡(luò)中的3方面及細(xì)胞周期G1/S檢查點(diǎn)均有重要的調(diào)控作用,Per2是重要的抑癌基因。在此研究基礎(chǔ)上,從蛋白質(zhì)水平和蛋白翻譯后修飾水平對Per2的深入研究有可能進(jìn)一步明確晝夜節(jié)律與細(xì)胞周期兩大周期活動(dòng)之間的相互作用以及與癌變發(fā)生的關(guān)系,為癌癥的治療提供新的有效分子靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：口腔黏膜上皮細(xì)胞 Tca8113 SCC15 細(xì)胞培養(yǎng) 正常口腔粘膜上皮細(xì)胞 Tca8113 SCC15 Per2 shRNA 質(zhì)粒 Per2 Tca8113 腫瘤 生物鐘 Per2 細(xì)胞周期 口腔鱗癌
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.85
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-18
• 前言18-23
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第一部分 口腔鱗癌細(xì)胞株培養(yǎng)和口腔黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)23-34
• 1 材料與方法23-29
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-31
• 3 討論31-32
• 4 小結(jié)32
• 5 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二部分 生物鐘基因Per2在不同口腔鱗癌細(xì)胞株及正�？谇火つど掀ぜ�(xì)胞中的表達(dá)34-47
• 1 材料和方法34-43
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43
• 3 討論43-45
• 4 小結(jié)45
• 5 參考文獻(xiàn)45-47
• 第三部分 Per2干擾質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證47-64
• 1 實(shí)驗(yàn)材料和方法47-60
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-61
• 3 討論61-62
• 4 小結(jié)62-63
• 5 參考文獻(xiàn)63-64
• 第四部分 Per2干擾后細(xì)胞的細(xì)胞周期分布?增殖和凋亡的變化及對細(xì)胞周期Cyclins-CDKs-CKIs網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用64-88
• 1 材料和方法65-79
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-81
• 3 討論81-83
• 4 小結(jié)83
• 5 參考文獻(xiàn)83-88
• 全文總結(jié)88-89
• 文獻(xiàn)綜述89-111
• 參考文獻(xiàn)99-111
• 致謝111-112
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章112

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 毛靜芳,韓枋;819例口腔鱗癌病理臨床分析[J];診斷病理學(xué)雜志;2000年02期

2 保森竹,孫[?[?,翁巧鳳,陳永賢;341例口腔鱗癌病例臨床分析[J];青海醫(yī)藥雜志;2001年07期

3 張雷,唐f展，

本文編號：561418