本文關(guān)鍵詞：人唾液腺多形性腺瘤XT-Ⅱ基因沉默對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：目的: 唾液腺多形性腺瘤(salivary pleomophic adenoma,SPA)是人唾液腺最常見的良性腫瘤。由于腫瘤含有腫瘤性肌上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞,雙層腺管結(jié)構(gòu),黏液樣組織和軟骨樣組織而呈現(xiàn)多形性。唾液腺多形性腺瘤作為良性腫瘤,文獻(xiàn)報(bào)道有復(fù)發(fā),神經(jīng)侵襲和轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。手術(shù)完整切除多形性腺瘤后,并不能除外腫瘤的復(fù)發(fā),侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。在臨床上,惡性多形性腺瘤往往是由于良性多形性腺瘤,多次復(fù)發(fā)惡變而來。鑒于唾液腺多形性腺瘤臨床復(fù)發(fā),侵襲和轉(zhuǎn)移的困惑,對(duì)于相關(guān)機(jī)理的研究成為熱點(diǎn)。蛋白多糖(proteoglycans,PGs)是一種細(xì)胞外基質(zhì),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。蛋白多糖合成限速酶——木糖基轉(zhuǎn)移酶(xylosyltransferase,XT),其包含的兩個(gè)亞型XT-I和XT-II逐漸引起研究者的興趣。王潔課題組近十年來,一直致力于蛋白多糖與唾液腺腫瘤生物學(xué)行為關(guān)系的研究。其結(jié)果已經(jīng)顯示,蛋白多糖與腺樣囊性癌的神經(jīng)侵襲和肺轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。本研究是國家自然科學(xué)基金資助課題。利用本實(shí)驗(yàn)室2002年建立的體外培養(yǎng)唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞的方法,采用RNA干擾技術(shù),將腺病毒載體Ad-sh RNA-XT-II轉(zhuǎn)染多形性腺瘤細(xì)胞。在基因水平,蛋白水平上檢測(cè)木糖基轉(zhuǎn)移酶XT-II,并檢測(cè)XT-II基因沉默后蛋白多糖合成的下降。蛋白多糖合成減少后,觀察其對(duì)多形性腺瘤細(xì)胞侵襲性和遷移性的影響。本研究還利用2012年本實(shí)驗(yàn)室獲得的一項(xiàng)專利技術(shù),構(gòu)建組織工程化纖維組織,建立多形性腺瘤的裸鼠移植瘤模型。在裸鼠體內(nèi)觀察多形性腺瘤木糖基轉(zhuǎn)移酶基因XT-II阻斷后,對(duì)腫瘤種植性生長生物學(xué)行為的影響。方法： 1沉默XT-II基因?qū)ν僖合俣嘈涡韵倭黾?xì)胞蛋白多糖合成的影響采用貼壁法培養(yǎng)唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞,利用免疫組織化學(xué)染色和Giemsa染色方法鑒定培養(yǎng)的多形性腺瘤細(xì)胞。構(gòu)建針對(duì)XT-II基因的腺病毒載體(Ad-sh RNA-XT-II)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染多形性腺瘤細(xì)胞,分為沉默組(SPA-XT-II組)、空載體組(SPA-HK組),以第三代多形性腺瘤細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組(SPA組)。Real-time PCR和Western blot蛋白印跡法分別檢測(cè)三組XT-II基因沉默效率和XT-II蛋白的抑制率。生物染色法檢測(cè)三組XT-II基因沉默后對(duì)蛋白多糖合成的影響。2沉默XT-II基因?qū)ν僖合俣嘈涡韵倭銮忠u性和遷移性的影響采用貼壁法培養(yǎng)唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞,利用免疫組織化學(xué)染色方法鑒定培養(yǎng)的多形性腺瘤細(xì)胞。腺病毒介導(dǎo)的質(zhì)粒載體(Ad-sh RNA-XT-II)轉(zhuǎn)染多形性腺瘤細(xì)胞,分為沉默組(SPA-XT-II組)、空載體組(SPA-HK組),以多形性腺瘤細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組(SPA組)。利用transwell侵襲小室和劃痕實(shí)驗(yàn),分別檢測(cè)蛋白多糖合成的變化對(duì)多形性腺瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性的影響。3沉默XT-II基因?qū)ν僖合俣嘈涡韵倭龇N植性生長的影響采用貼壁法分別培養(yǎng)唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞和包膜成纖維細(xì)胞。將成纖維細(xì)胞接種于經(jīng)5%氫化可的松完全培養(yǎng)液浸泡的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)支架材料上,構(gòu)建組織工程化纖維組織。采用HE染色和掃描電鏡,觀察組織工程化纖維組織的構(gòu)建情況。將處于對(duì)數(shù)生長期的沉默組細(xì)胞(SPA-XT-II組),空載體組細(xì)胞(SPA-HK組)和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(SPA組)種植于組織工程化纖維組織上,以HE染色,免疫組織化學(xué)染色和掃描電鏡方法,觀察種植在組織工程化纖維組織上的多形性腺瘤細(xì)胞體外生長情況。再分別將上述三組細(xì)胞,接種于18只BALB/C-nu裸鼠背部皮下,每組6只。在裸鼠體內(nèi)生長三個(gè)月后,麻醉下取出移植瘤。進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色,觀察多形性腺瘤在裸鼠體內(nèi)種植性生長的情況。結(jié)果： 1沉默XT-II基因?qū)ν僖合俣嘈涡韵倭黾?xì)胞蛋白多糖合成的影響1.1留取人唾液腺多形性腺瘤標(biāo)本,經(jīng)兩名病理醫(yī)師確診為多形性腺瘤。1.2唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞1周,即可在倒置顯微鏡下可觀察到組織塊周圍爬出細(xì)胞,大約在2周后原代培養(yǎng)細(xì)胞即可達(dá)到80~90%融合。傳代細(xì)胞為多邊形,細(xì)胞核圓形或橢圓形,可見1~2個(gè)核仁,偶見雙層腺管結(jié)構(gòu)。1.3唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞鑒定Giemsa染色顯示:腫瘤性腺上皮細(xì)胞多呈圓形,胞核圓形。腫瘤性肌上皮細(xì)胞呈多邊形,胞核較大,可見2~3個(gè)深染的核仁。腫瘤性肌上皮細(xì)胞分泌的蛋白多糖呈紫紅色顆粒,分布于細(xì)胞外。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:腫瘤性肌上皮細(xì)胞對(duì)抗calponin,S-100蛋白,α-SMA均呈陽性反應(yīng)。1.4腺病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染多形性腺瘤細(xì)胞1%瓊脂糖凝膠結(jié)果及測(cè)序結(jié)果顯示,Ad-sh RNA-XT-II目的序列與設(shè)計(jì)序列完全匹配,表明腺病毒構(gòu)建成功。腺病毒介導(dǎo)的質(zhì)粒載體(Ad-sh RNA-XT-II)轉(zhuǎn)染多形性腺瘤細(xì)胞,分為沉默組(SPA-XT-II組)、空載體組(SPA-HK組)和未轉(zhuǎn)染組(SPA組)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白,其轉(zhuǎn)染率近100%。未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(SPA組)未見綠色熒光表達(dá)。1.5 Real-time PCR檢測(cè)XT-II的基因沉默效率根據(jù)△△CT計(jì)算方法得到三組細(xì)胞基因相對(duì)表達(dá)量。沉默組XT-II基因m RNA表達(dá)降低43%。基因沉默組與空載體組和未轉(zhuǎn)染組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。1.6 Western blot檢測(cè)XT-II蛋白含量Gene Tool檢測(cè)Western blot樣本條帶相對(duì)定量分析結(jié)果顯示:沉默組中,XT-II蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.44±0.09;空載體組中XT-II蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.86±0.16;未轉(zhuǎn)染組中XT-II蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.77±0.11。沉默組比較未轉(zhuǎn)染組XT-II蛋白相對(duì)表達(dá)量降低34%�？蛰d體組未見XT-II蛋白表達(dá)降低。1.7多形性腺瘤細(xì)胞蛋白多糖合成量檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,1×106細(xì)胞分泌蛋白多糖含量為:沉默組47.78±3.16μg;空載體組77.58±2.01μg;未轉(zhuǎn)染組81.18±2.80μg。沉默組比較未轉(zhuǎn)染組蛋白多糖合成量降低41.14%�？蛰d體組比較未轉(zhuǎn)染組蛋白多糖合成量降低4.43%。單因素方差分析結(jié)果顯示:沉默組分別與空載體組、未轉(zhuǎn)染組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),空載體組和未轉(zhuǎn)染組未見明顯差異。2沉默XT-II基因?qū)ν僖合俣嘈涡韵倭黾?xì)胞侵襲性和遷移性的影響2.1唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng),鑒定和轉(zhuǎn)染同第一部分。2.2 Transwell侵襲小室檢測(cè)多形性腺瘤細(xì)胞侵襲性經(jīng)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的沉默組細(xì)胞,空載體細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)過96小時(shí)培養(yǎng),各組細(xì)胞穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)為:沉默組14.40±2.50;空載體組39.90±4.61;未轉(zhuǎn)染組40.80±4.63。沉默組細(xì)胞侵襲性抑制率64.70%,空載體組細(xì)胞侵襲性抑制率2.21%。單因素方差分析結(jié)果顯示,沉默組與空載體組、未轉(zhuǎn)染組比較差異有顯著性,空載體組與未轉(zhuǎn)染組比較差異無顯著性。2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多形性腺瘤細(xì)胞的遷移能力轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí),細(xì)胞爬過致傷區(qū)的距離顯示:沉默組262.27±219.50像素;空載體組1166.17±276.94像素;未轉(zhuǎn)染組956.83±212.04像素。沉默組細(xì)胞遷徙抑制率為72.60%�？蛰d體組未見明顯細(xì)胞遷移抑制。單因素方差分析顯示:沉默組與空載體組、未轉(zhuǎn)染組差異有顯著性,空載體組與未轉(zhuǎn)染組差異無顯著性。3沉默XT-II基因?qū)ν僖合俣嘈涡韵倭龇N植性生長的影響3.1唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞培養(yǎng)鑒定結(jié)果同第一部分。3.2唾液腺多形性腺瘤包膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)多形性腺瘤包膜成纖維細(xì)胞呈細(xì)長梭形,排列成放射狀或漩渦狀。免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光化學(xué)染色顯示:人成纖維細(xì)胞對(duì)抗vimentin表達(dá)陽性。3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:同第一,二部分。3.4組織工程化纖維組織的觀察HE染色及掃描電鏡觀察顯示,成纖維細(xì)胞成功接種于ADM支架上。3.5組織工程化纖維組織種植多形性腺瘤細(xì)胞的體外觀察沉默組細(xì)胞(SPA-XT-II組),空載體組細(xì)胞(SPA-HK組)和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(SPA組)接種于組織工程化纖維組織上,同樣命名為沉默組(SPA-XT-II組),空載體組(SPA-HK組)和未轉(zhuǎn)染組(SPA組)。HE,免疫組織化學(xué),掃描電鏡觀察顯示,成纖維細(xì)胞平鋪排列,腫瘤細(xì)胞分布于成纖維細(xì)胞之間。沉默組可見腫瘤細(xì)胞“抱團(tuán)”分布現(xiàn)象,空載體組和未轉(zhuǎn)染組可見腫瘤細(xì)胞位于成纖維細(xì)胞之間。3.6組織工程化纖維組織上種植的多形性腺瘤在裸鼠體內(nèi)生長的觀察3.6.1在裸鼠體內(nèi)生長3個(gè)月后,麻醉下取出移植瘤。肉眼觀察發(fā)現(xiàn),三組的支架組織在裸鼠體內(nèi),與裸鼠的血管和組織粘連。肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤瘤體。3.6.2組織學(xué)觀察結(jié)果3.6.2.1 HE染色發(fā)現(xiàn),SPA-XT-II組可見裸鼠脂肪細(xì)胞長入組織工程化纖維組織中,并可見血管,未見多形性腺瘤細(xì)胞生長。SPA-HK組和SPA組中,裸鼠脂肪細(xì)胞均長入組織工程化纖維組織中,可見成片的多形性腺瘤細(xì)胞生長,具有典型的多形性腺瘤組織學(xué)特征。在多形性腺瘤中,腫瘤性肌上皮細(xì)胞成片狀增生,并與腺上皮細(xì)胞形成雙層腺管結(jié)構(gòu),腺腔內(nèi)有嗜伊紅染色物質(zhì),腫瘤中可見黏液樣區(qū)域。3.6.2.1免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),SPA-XT-II組中未見腫瘤細(xì)胞。SPA-HK組和SPA組多形性腺瘤中的腫瘤性肌上皮細(xì)胞對(duì)抗S-100蛋白,CK818,α-SMA均呈陽性表達(dá)。結(jié)論：1成功構(gòu)建沉默XT-II基因的腺病毒表達(dá)載體。2沉默XT-II基因能成功抑制多形性腺瘤蛋白多糖的生物合成。3阻抑蛋白多糖合成,多形性腺瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性降低。4阻抑蛋白多糖合成,多形性腺瘤種植性生長受到阻斷。
【關(guān)鍵詞】：多形性腺瘤 蛋白多糖 RNA干擾技術(shù) 木糖基轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ 組織工程 唾液腺腫瘤
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.8
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-16
• 英文縮寫16-17
• 引言17-19
• 第一部分 XT-II基因沉默對(duì)唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞蛋白多糖合成的影響19-58
• 前言19-20
• 材料與方法20-34
• 結(jié)果34-36
• 附圖36-50
• 附表50-52
• 討論52-54
• 小結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 第二部分 蛋白多糖阻抑對(duì)唾液腺多形性腺瘤細(xì)胞侵襲性及遷移性的影響58-75
• 前言58-59
• 材料與方法59-62
• 結(jié)果62-63
• 附圖63-69
• 附表69-70
• 討論70-72
• 小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-75
• 第三部分 蛋白多糖阻抑對(duì)唾液腺多形性腺瘤種植性生長的影響75-110
• 前言75-76
• 材料與方法76-80
• 結(jié)果80-82
• 附圖82-105
• 附表105-106
• 討論106-108
• 小結(jié)108-109
• 參考文獻(xiàn)109-110
• 結(jié)論110-111
• 綜述一111-120
• 參考文獻(xiàn)116-120
• 綜述二120-125
• 參考文獻(xiàn)123-125
• 致謝125-126
• 個(gè)人簡歷

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本文編號(hào)：555251